限制性内切酶酶切位点保护碱基

1、寡核甘酸近末端位点的幅切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments （oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核甘酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切 顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNAC端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加 上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用丫- 32PATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡 核甘酸。取1 pg已标记了的寡核甘酸

2、与20单位的内切酶，在20。C条件下分别 反应2小时和20小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl 2 , 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl （视酶的具体要求而定）。20%勺PAGE（7 M尿素） 凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核甘酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发火结构而降低。DNA合成，新链的延伸方向是 5-3因此，需要在5端加上酶切位点，因为内切酶除了有特 异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5-

3、3）:保护碱基+酶切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选（小虾米酶切位点分析）。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变|1酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CCACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90LAsc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12&

4、gt;90>90Ava ICCCCGGG G850>90CCCCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90BamH ICGGATCC GCGGGATCC CG CGC GGATCC GCG8101210>90>9025>90>90%gl IICAGATCT G800GAAGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)A

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6、C GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hind IIICAAGCTT G800CCAAGCTT GG1000CCC AAGCTT GGG121075Kpn IGGGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT C800CG ACGCGT CG102550I-Nco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CCCATATG GG1000CGC CATATG GCG

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9、IIGGAA24>90>90CIGCAG AACCAAIGCAIIGGAIGCAI2600Pvu ICCGAICG G800AICGAICG AI101025ICG CGAICG CGA12010Sac ICGAGCIC G81010Sac IIGCCGCGG C800ICC CCGCGG GGA1250>90Sal IGICGAC GICAAAAGGCCAIAGCGGCCGC2800GC GICGAC GICIIGGCCAIAGCGGCCGCGG301050ACGC GICGAC GICGGCCAIAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025

10、AAAAGIACI III127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050ICC CCCGGG GGA12>90>90Spe IGACIAGI C810>90GGACIAGI CC1010>90CGGACIAGI CCG12050CIAG ACIAGI CIAG14050Sph IGGCAIGC C800CAI GCAIGC AIG12025ACAI GCAIGC AIGI141050Stu IAAGGCCI I8>90>90GAAGGCCI IC10>90>90AAAAGGCCI III12>90>90Xba ICICIAGA G800GC ICIAGA GC10>90>90IGCICIAGA GCA1275>90CIAG ICIAGA CIAG1475>90Xho ICCICGAG G800CC CICGAG GG101025CCG CICGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CCCCCGGG GG102575CCC CCC