多聚酶链式反应PCRPPT学习教案

1、会计学1多聚酶链式反应多聚酶链式反应PCR教材分析教材分析第1页/共36页教材分析教材分析第2页/共36页PCRPCR的应用，以激发学生的学习的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。兴趣，然后再说明本课题的目标。教材分析教材分析第3页/共36页教材分析教材分析第4页/共36页DNA3DNA链、链、而不能从头合成而不能从头合成DNA等。等。教学建议教学建议第5页/共36页教学建议教学建议第6页/共36页教材分析教材分析第7页/共36页深理解。当学生遇到难以理解深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解的地方时，教师要及时给予解答。答。教学建议教学建议第8页/共36页nn第

2、9页/共36页第10页/共36页加样器的使用加样器的使用第11页/共36页第12页/共36页DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeat第13页/共36页多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCR） 扩增扩增DNA片段片段 第14页/共36页第15页/共36页第16页/共36页PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物一生二，二生四，四生万物 PCR PCR三步曲三步曲变性变性 90909797退火退火 45456565延伸延伸 7272左右左右PCRPCR过程过程第17页

3、/共36页第18页/共36页等其他领域。等其他领域。第19页/共36页第20页/共36页 PCR PCR反应体系的五要素反应体系的五要素： 引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和MgMg2+2+Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 来自水生栖热菌来自水生栖热菌 Thermus aquaticusThermus aquaticus 良好的耐热性良好的耐热性 MgMg2+2+依赖性依赖性 无校读功能无校读功能第21页/共36页第22页/共36页四、实验步骤四、实验步骤 第23页/共36页第24页/共36页均均一次性一次性使用，及使用，及时更换；时更换；第25页/共36页第26页/

4、共36页第27页/共36页第28页/共36页DNA Marker NGF2000bp1000bp750bp 500bp250bp100bp220bp第29页/共36页 PCR PCR引物设计引物设计一对引物，分别与靶一对引物，分别与靶DNA5DNA5和和3 3端互补端互补长度：长度：15153030个核苷酸个核苷酸引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性引物与非特异扩增区无同源性引物的设计可以参照：引物的设计可以参照： 两分钟两分钟StepByStep学会引物设计软件学会引物设计软件 软件软件 核酸基因技术讨论版核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版生物

5、信息学讨论版/ PCR技术讨论版技术讨论版第30页/共36页引物设计：引物设计：1.长度在长度在15-30bp，GC含量在含量在45-55%之间。之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T)。2. 碱基分布表现出随碱基分布表现出随机机性，避免相同碱基连续性，避免相同碱基连续 排列。排列。3. 3不能与引物内部互补，以免形成二级结构。不能与引物内部互补，以免形成二级结构。4. 两个引物各自的两个引物各自的3不能互补，以免形成自身不能互补，以免形成自身 扩增。扩增。5. 引物必须经引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他查询后，证实没有与其他 非目的非目的DNA高度互补，才能使用。高度互补，才能

6、使用。第31页/共36页PCRPCR的反应特点的反应特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高：PCRPCR产物的生成量是以指数方式产物的生成量是以指数方式增加的，能将增加的，能将pg=10pg=10- 12- 12级的起始待测模板扩级的起始待测模板扩增到微克增到微克( ( g= 10 g= 10 -6-6) )水平水平简便、快速简便、快速：PCRPCR反应一般在反应一般在2 24 4 小时完小时完成扩增反应成扩增反应 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低： DNA DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测