植物生物技术

1、 植物花粉和花药培养花粉培养花粉培养花药培养花药培养第一节 花粉培养花粉培养（花粉培养（pollen culturepollen culture）：）：是指当花粉发育到一定阶段，从花药中分离出单个花粉是指当花粉发育到一定阶段，从花药中分离出单个花粉粒，接种到培养基上改变正常发育和机能，不经受精作用而发生细胞分裂并诱导单倍体再生植株粒，接种到培养基上改变正常发育和机能，不经受精作用而发生细胞分裂并诱导单倍体再生植株的方法。的方法。l花粉培养的意义花粉培养的意义l花粉小孢子发育途径花粉小孢子发育途径l花粉分离方法花粉分离方法l花粉培养的方法花粉培养的方法l花粉植株形态发生方式花粉植株形态发生方式l

2、花粉植株的再生与驯化移栽花粉植株的再生与驯化移栽l影响花粉培养的主要因素影响花粉培养的主要因素一、花粉培养的意义l花粉培养是细胞工程育种中的重要花粉培养是细胞工程育种中的重要手段之一。手段之一。l在育种领域花粉培养与常规杂交育在育种领域花粉培养与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合。是生物技术在转基因技术相结合。是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一。效的方法之一。二、花粉小孢子发育途径二、花粉小孢子发育途径（一）小孢子的正常发育（一）小孢子的正常发育（二）离体培养条件下的小孢子发育（二）离体培养条

3、件下的小孢子发育离体培养的原始细胞：离体培养的原始细胞：花粉花粉花粉形成植株的途径称为花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径花粉孢子体发育途径根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核的发育分为：根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核的发育分为：A途径（不均等分裂）：花粉的营养细胞途径（不均等分裂）：花粉的营养细胞 不均等分裂不均等分裂 数次有丝分裂数次有丝分裂 花粉粒花粉粒 多细胞团多细胞团 胀破花粉壁胀破花粉壁 胚状体胚状体 生殖核不参与花粉孢子体的形成生殖核不参与花粉孢子体的形成B途径（均等分裂）：单核小孢子途径（均等分裂）：单核小孢子 均等分裂均等分裂 细胞壁将小孢子分隔细胞壁将小孢子分隔

4、两个营养型细胞两个营养型细胞 两次分裂两次分裂 多细胞花粉多细胞花粉 胀破胀破 花粉壁花粉壁 胚状体或愈伤组织胚状体或愈伤组织 C途径（不均等分裂、途径（不均等分裂、 ： 产生非单倍体植株）产生非单倍体植株）已经进行过第一次配子体有丝分裂花粉中已经进行过第一次配子体有丝分裂花粉中 营养核与生营养核与生殖核融合殖核融合 一次分裂一次分裂 花粉植株花粉植株生殖核和营养核共同参与花粉孢子体的形成生殖核和营养核共同参与花粉孢子体的形成。三、花粉分离方法取小孢子处于单核中晚期的新鲜材料，接种前先经低温（取小孢子处于单核中晚期的新鲜材料，接种前先经低温（810810）预）预处理，然后选用下列方法游离小孢子

5、。处理，然后选用下列方法游离小孢子。（一）机械分离法：单核中期花粉的幼花蕾（一）机械分离法：单核中期花粉的幼花蕾 消毒消毒 无菌水冲洗无菌水冲洗 花药花药 培养液培养液 挤压花药挤压花药 花粉粒花粉粒 40m网筛过滤网筛过滤 花粉悬浮液花粉悬浮液 500800r/min离心离心3min 弃上清弃上清 离心离心 三次三次 花粉密度调整至花粉密度调整至1*1045*104个个/mL 机械分离对花粉造成损伤较大机械分离对花粉造成损伤较大（二）（二）散落花粉法：花药散落花粉法：花药 液体培养基悬浮液体培养基悬浮 花粉自然释放花粉自然释放 取走花药取走花药。四、花粉培养的方法 （一）（一）液体培养液体培

6、养 （二（二）双层培养法双层培养法：在琼脂培养基上部加入薄层液体花粉培养液进行培养。可以保持良：在琼脂培养基上部加入薄层液体花粉培养液进行培养。可以保持良 好湿度，利于花粉生长。好湿度，利于花粉生长。 （三）（三）看护培养看护培养：将单个花粉接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是操作简将单个花粉接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是操作简 便，成功率高；缺点是不能再显微镜下直接观察。便，成功率高；缺点是不能再显微镜下直接观察。 （四）（四）微室培养微室培养：将花粉接种于一个由上下两个盖玻片与一金属圈封闭围成的小室内，：将花粉接种于一个由上下两个盖玻片与一金属圈封闭围成的小室内，一一

7、 定条件下培养。其特点是可以循环供应营养液。最大优点是花粉生长定条件下培养。其特点是可以循环供应营养液。最大优点是花粉生长可可 以尽量少地受到代谢产物积累的影响。以尽量少地受到代谢产物积累的影响。花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、看护培养、微室培养。液体浅层培养法：悬浮花粉在培养皿中形成一浅薄膜液体浅层培养法：悬浮花粉在培养皿中形成一浅薄膜 优点：易于添加新鲜培养基，可以镜检优点：易于添加新鲜培养基，可以镜检液体悬浮培养法：花粉分散接种于液体培养基中液体悬浮培养法：花粉分散接种于液体培养基中 优点：营养吸收和环境条件好，大规模培养优点：营养吸收和环境条件好，大规模培养。五、花粉植株形态发

8、生方式五、花粉植株形态发生方式（一）器官发生途径（一）器官发生途径愈伤组织愈伤组织 适当比例生长素和细胞分裂素的分化培养基适当比例生长素和细胞分裂素的分化培养基 产生芽或根产生芽或根 小植株小植株（二）胚状体发生途径（二）胚状体发生途径 胚状体胚状体 心形期心形期 鱼雷期鱼雷期 子叶期子叶期 小植株小植株。六、花粉植株的再生与驯化移栽l植株长至植株长至56片叶以上大小时可进行移栽。片叶以上大小时可进行移栽。移栽前的驯化：打开培养容器，室内自然移栽前的驯化：打开培养容器，室内自然光下放置光下放置34d，取出小苗，洗去培养基，取出小苗，洗去培养基，移入准备好的基质中。移入准备好的基质中。七、影响花

9、粉培养的主要因素七、影响花粉培养的主要因素l（一）供体植株的基因型：基因型不同，诱导形成再生植株的难易程度有较大差异（一）供体植株的基因型：基因型不同，诱导形成再生植株的难易程度有较大差异l（二）供体植株的生理状态和栽培条件：植株的生理形态和接种季节对花药愈伤组织（二）供体植株的生理状态和栽培条件：植株的生理形态和接种季节对花药愈伤组织 诱导率有显著变化诱导率有显著变化l（三）花粉发育时期：随着供体植株的老化，花粉对离体培养的反应能力大大下降（三）花粉发育时期：随着供体植株的老化，花粉对离体培养的反应能力大大下降l（四）培养前和培养初期的预处理：预处理措施主要是低温处理。机理：一是低温可（四）

10、培养前和培养初期的预处理：预处理措施主要是低温处理。机理：一是低温可 以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体轴向；二以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体轴向；二 是低温作用可以使花粉保持较长时间的活力是低温作用可以使花粉保持较长时间的活力l（五）培养基：花粉愈伤组织分化为植株需要较低浓度生长素和高浓度细胞分裂素；（五）培养基：花粉愈伤组织分化为植株需要较低浓度生长素和高浓度细胞分裂素； 花粉植株诱导频率随培养基中蔗糖浓度升高而增大花粉植株诱导频率随培养基中蔗糖浓度升高而增大 小孢子培养过程中会产生有毒物质，注意活性炭的添加和培养基的更换小孢子培养过程中会产生有毒物质，注意活性炭的添加和培养基的更换l

11、（六）培养条件（六）培养条件光照光照温度温度。第二节 花药培养l一、花药培养的意义一、花药培养的意义l二、花药的采集和处理二、花药的采集和处理l三、花药培养三、花药培养l四、影响花药培养效率的因素四、影响花药培养效率的因素l五、花药单倍体植株的再生与鉴定五、花药单倍体植株的再生与鉴定l六、单倍体植株的染色体加倍六、单倍体植株的染色体加倍花药培养（花药培养（anther cultureanther culture）：）：将完整的花药接种到培养基上使花粉粒改变正常发育和将完整的花药接种到培养基上使花粉粒改变正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，诱导形成单倍体再生植株的过程。机能，不经受精而发生细

12、胞分裂，诱导形成单倍体再生植株的过程。一、花药培养的意义 为了获得单倍体植株，为基础为了获得单倍体植株，为基础研究和育种提供有用的材料研究和育种提供有用的材料二、花药的采集和处理l（一）花药的采集：选取生命力强、颗粒饱满的花药，一（一）花药的采集：选取生命力强、颗粒饱满的花药，一 般以花粉单核中、晚期为佳般以花粉单核中、晚期为佳l花药花药 的的 处理处理1、低温预处理低温预处理：较低温度处理时间段，较高温度处理时间长：较低温度处理时间段，较高温度处理时间长2、秋水仙碱液预处理：秋水仙碱液预处理：秋水仙碱是一种染色体加倍剂，阻碍纺锤丝的形成秋水仙碱是一种染色体加倍剂，阻碍纺锤丝的形成3、甘露醇预

13、处理：甘露醇预处理：可提高成功率可提高成功率。三、花药培养l（一）培养基（一）培养基l（二）培养条件（二）培养条件l（三）培养过程（三）培养过程碳源：碳源：高浓度蔗糖不利于体细胞的生长，但不妨碍花药高浓度蔗糖不利于体细胞的生长，但不妨碍花药 的生长的生长氮源：氮源：有机氮源对细胞初级培养的早期生长有利有机氮源对细胞初级培养的早期生长有利植物生长调节剂：植物生长调节剂：生长素和细胞分裂素比例适生长素和细胞分裂素比例适 当，能促进孢子体的小孢子发育当，能促进孢子体的小孢子发育。四、影响花药培养效率的因素l（一）供试材料的基因型（一）供试材料的基因型l（二）供试材料的生理状态（二）供试材料的生理状态l（三）花粉的发育时期（三）花粉的发育时期。五、花药单倍体植株的再生与鉴定花药发育成小植株有愈伤组织和胚状体两种发育途径。再生花药发育成小植株有愈伤组织和胚状体两种发育途径。再生植株并非完全由小孢子发育而来。植株并非完全由小孢子发育而来。鉴定再生植株的来源：鉴定再生植株的来源：遗传学，一般是通过染色体数量来确定植物的倍性遗传学，一般是通过染色体数量来确定植物的倍性形态学层次，观察不同倍体植株生长发育时的形态特征差异，间接确定植物倍形态学层次，观察不同倍体植株生长发育时的形态特征差异，间接确定植物倍性性分子生物学层次，流式细胞仪测定基因组分子生物学层