大肠杆菌电转化感受态细胞制备

1、大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1将适合菌株（如XL1-Blue, DH5置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37° 下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基的1-2升 挡板摇瓶中5. 37 C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控0.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟 （需要的话这种方式可以存放

2、培养液数小时8细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油 中保存一两天9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中 （几毫升，然后加水稀释至离心管的2/3体积。10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为 2-3ml16. 将细胞按150卩等份装入微量离心管，于-80 °保存转化方法：1.

3、 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10卩l DNA冰上培育约5分钟2. 添加1-3卩l DNA冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡中4. 加载P1000准备好300卩l LB或2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆,25卩Fd, 2千伏（检查时间常数，应该在3以 上6. 立即添加300卩的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体细胞，使之无性繁殖 并高效表达外源基因

4、或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于 供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种 感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌 龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大 促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感 受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积

5、15%的无菌甘油或-70C保存 （有效期6个月。2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组 DNA导入 细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等 研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如:电击法,CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCI2法,该法最先是由Cohen于1972年发现的。 其原理是细菌处于0C,CaCI2的低渗溶液

6、中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热冲击处 理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂 增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的 转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5X1062X107转化子/ug质粒 DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在 Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高1001000 倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细

7、菌可以在-70C 保存,因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依 靠短暂的电击 促使DNA进入细菌，转化率最高能达到1091010转化子/ug闭环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。3、感受态细胞制备及转化中的影响因素、细胞的生长状态和密度最好从-70 r或-20 r甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 不要用已经过多次转接，及贮存在4r的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细 胞数在5X107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌 ，可通过测定培养 液的OD600控制。对TG1菌株,OD600为0.5

8、时，细胞密度在5X07个/ml左右。（应 注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同。密度过高或不足均会使 转化率下降。此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲 基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定 范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。 一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%,1 ng的cccDNA即可使 50ul的感受态细胞达到饱和对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低

9、，实验证明，大于30kb 的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关， 环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新 的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂 DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。大肠杆菌感受态细胞制备及外源 DNA的转化实验目的1. 了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2. 学习氯化钙法制备大肠杆菌

10、感受态细胞的方法。3. 学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。实验原理转化（Transformation是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新 的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验 技术。转化中的受体细胞：转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变 异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。转化方法：电击法、CaCI2、RuCI等化学试剂法感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过 时细胞的状态。转化细胞（转化子:带有异源DNA分子的受体细胞（Transformant。本

11、实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCI2处理受体菌使其处于为感受态 然后与pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而 使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后 的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才 能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。影响转化率的因素细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA的污染。实验仪器离心设备实验试剂大肠杆菌DHa LB培养基,0.1mol/LCaCI2溶液（预冷氨苄青霉素 pUC1

12、8质粒实验步骤菌株活化：1用接种环直接取冻存的大肠杆菌 DH5a在LB培养基平板表面划线，于37C培 养16小时2. 挑取一个单菌落，转到3-5mlLB培养基中，于37C培养3-5小时3. 将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2-3小时倒0D600=0.3-0.4感受态 细胞制备：4. 将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15-30min5.4000rpm离心5min,弃上清6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCI2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5 min,弃上清8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCI2,悬浮沉淀即可使用。也可加入总体积15% 的甘油可-70C长期保存外源DNA的转化：9. 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min10. 于42 C水浴90S11. 冰上放置2min12加入800卩lLB液体培养基于37培养1小时13. 将培养液均匀涂布在含 Amp+的培养基平板上14. 将平板放置于37E恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果对照组对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液,其它操作与上面相同。此组 正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA溶液,但涂板时只取5卩菌液涂布于 不含抗生素的LB平板上，此