质粒提取总结原理小提中提浓度测定

1、碱裂解法抽提质粒原理溶液 I, 50 mM 葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA, pH 8.0;（溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的 RNA去除，防止 RNA污染）溶液 II, 0.2 N NaOH / 1% SDS;溶液III, 3M醋酸钾/ 2 M醋酸。溶液I的作用： 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液。 50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 ED

2、TA EDTA是Ca2+e Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液 I中加入高达10 mM的EDTA无 非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。溶液II:这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要

3、新从浓 NaOH稀释制备0.4N的NaOH,是为了保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而 减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊） 结构的相变化所导致。 用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌， 自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉

4、淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH溶解的 细胞，那为什么要加 SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。溶液III溶液III加入后就会有大量的沉淀，最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SD晞液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，

5、也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入 5 N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫 酸钠(sodium dodecyl sulfate )遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate,PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶

6、性的PD§而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的 DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管 SDS并不与DNA分子结合。那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50100 kb大小的片断，就没 有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的

7、质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了， 这是天大的误会， 因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶 III加 入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降

8、解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但 是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液(比如4M的异硫停酸月瓜)，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大 量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应)，应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会

9、被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进 行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA沉淀出来。这时候如果放到 -20 C,时间一长反而会导致大量盐的沉淀， 这点不同于普通的 DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水 分子，因DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果沉淀，就用70%的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase (50ug/ml )的TE缓冲液

10、进行溶解， 不然大量未降解的 RNA会干扰电泳结果 的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒 DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液 II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb的大肠杆菌基因组 DNA的片断。质粒小提质粒/、提（这里试剂盒没有柱平衡步骤

11、 ）：1、大离心管4000rpm离心5min ,吸除上清；2、每5ml菌液加入250 P1 （4C）,彻底悬浮，移到 1.5ml EP离心管中;3、加入250 P2,上下颠倒 6-8次，温和，v 5min；4、加入350 P3,上下颠倒 6-8次，温和；12000rpm离心10min；5、 取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min ,弃废液；6、加入去蛋白液 HB 500心12000rpm离心1min,弃废液；7、加入75%乙醇700心12000rpm离心1min,弃废液；8、重复上一步；9、空离一次，12000rpm离心2min ,弃收集管；10、晾干；11、加 ddH2O 溶解，放

12、 2min, 12000rpm 离心 2min。12、测浓度 质粒小提试剂盒（离心柱型）：天跟本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。1、 柱平衡：向吸附柱 CP3（吸附柱放入收集管中）加入 500 的平衡液BL, 12000rpm 离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；2、取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min, 尽量吸除上清；注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3、 向离心管中加入250 溶液P1 （先检查是否加入 RNase A）,使用移液器

13、或涡旋振荡 器彻底悬浮细菌沉淀；4、 向离心管中加入 250引溶液P2 （使用后立即盖上瓶盖，以免空气中的CO2中和P2 中的NaOH反应，降低溶菌效率），温和地上下翻转 6-8次，使菌液充去裂解；注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA,造成提取的质粒中混有基 因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5min,以免质粒收到破坏， 如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5、 加入350 溶液P3,立即温和地上下翻转 68次，充分混匀，此时会出现白色絮状 沉淀，12000rpm 离心 10min；注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

14、如果上清中还有微小白色沉淀，可 再次离心后取上清。6、 吸取上一步上清液转移至吸附柱CP3中（吸附柱放入离心管中），尽量不要吸出沉 淀，12000rpm离心1min ,倒掉收集管中废液，将吸醐柱放入收集管中；7、 可选步骤：向吸附柱 CP3中加入500 l去蛋白液 PD, 12000rpm离心30-60sec ,倒 掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是 end A+宿主菌（TG1, BL21, HB101, JM系列，ET12567等），这些宿主菌 含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA推荐采用此步。如果宿主菌是 end A-宿主菌（DH& , TOP10等），此

15、步可省略。8、 向吸附柱 CP3中加入600引漂洗液PW （先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；9、重复操作步骤8;10、 将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心两分钟，目的是将吸附柱中残余的漂 洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、 PCR等）实验。为确保下游 实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱 CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液。11、 将吸附柱 CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 g洗脱 缓冲液EB,室温放置2min, 1

16、2000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50用体积过小影响回收效率。洗脱液的PH值对于洗 脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用 ddH2O做洗脱液，并保证其PH在7.0-8.5范围 内，PH低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20C，以防DNA降解。为了增加 质炕的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置 2min , 12000rpm离心2min, 将质粒溶液收集到离心管中。质粒中提实验步骤(E.Z.N.A.tm EndoFree Plasmid Midi Kit)实验前准备1. 使用前，将RNase A全部加入Solution

17、I中并于4度保存。2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存。D6915-01:加入80ml无水乙醇D6915-03:每瓶加入200ml无水乙醇D6915-04:每瓶中加入200ml无水乙醇操作方案1. 将带有质粒的 E.coli接种于30-50ml LB/抗生素培养液中，37° C摇床培养1216 h;2. 取30-50ml的菌液，室温下 3500-5000xg （4000）离心10min收集细菌。3. 倒弃培养基。加入 2.5ml Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。4. 往重悬混和液中加入 2.5ml Solution

18、II,轻轻颠倒混匀 7-10次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不要超过5 min。5. 加入1.25ml冰浴Buffer N3 ,并温和颠倒离心管数次至形成白色絮刃犬沉淀。准备好过滤 器。6. 把H旧ind中量柱套在收集管中，加入2ml Buffer GPS至柱子中，静置3-10min。室温3000-5000xg离心5分钟。去滤液，把柱子重新放回收集管中。7. 将裂解液倒进预先准备好的针筒过滤器中（针筒开口朝上，下面出口处接收集管），静置2min。8. 插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。9. 在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR,颠倒7-10

19、次后溶液变得浑浊，冰浴10-20min。10. 42° C水浴5min后，25° C , 3000-5000xg离心5min , ETR溶液将在管底形成蓝色分层。离心后，如果溶液中有大量的液滴悬浮，静置10分钟让液滴自然沉降。11. 转移上清液移至离心管中，加入 0.5倍体积无水乙醇（室温），混匀后室温静置 1-2min。12. 将HiBind中量柱装在15ml收集管中。转移20ml （分两次转,具体看实际）混合液至 柱子内，室温下 3000-5000xg离心3-5 min,倒去滤液。13. 重复该第12步骤，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。14. 把

20、柱子重新装回收集管，加入 3ml HB Buffer,按上述条件离心，弃滤液。15. 把柱子重新装回收集管，加入 3.5ml DNA Wash Buffer,按上述条件离心，弃滤液。16. 重复步骤15 一次。17. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，最大速度（<6000xg, 4000）离心10-15min以甩干柱子基质。18. 放十分钟左右晒干，然后将柱子放在新离心管中，向柱子中心加 0.5-1ml ddH 2。，4000xg 离心5min 测浓度。【18.（可选）进一步干燥柱子，将柱子从收集管中取出，用真空抽滤装置抽干柱子10min后，也可在真空烘箱或 65 ° C干燥10min后重复步骤17。19. 把柱子装在干净的15ml离心管上，加入 70° C预热的0.5-1