免疫组化非特异性染色的消除方法

1、免疫组化非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3 ）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman 氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗 体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于 正常组织上而呈

2、现非特异性染色。（6）荧光素不纯，标本固定不当等。二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠） ，其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h , 4C中过夜，再搅拌 10min，高速离心（300015000r/min ） 30min， 12次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行， 吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过 2 周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水 将组织干粉浸湿，离心（ 3000

3、15000r/min ） 30min ，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收， 以免消耗过多的抗体。肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。 如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos 氏等的方法将组织的 20% 生理盐水匀浆液，用生理盐水洗 2 3 次， 12000r/min10min 离心沉淀， 用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的， 京极方久氏认为这样吸收对荧 光抗体几乎没有损失， 他们常用此法， 效果甚佳， 吸收后放置一周左右， 用时有必要再吸收一次。 【肝

4、粉的制法】（1 ）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗23 次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。（ 2 ）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器 作成匀浆。（3）将肝匀浆装入离心管内（ 1/3 左右），交换地用 2 3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次， 至上清无血色止，每次完毕先用 2000r/min 离心沉淀 15 min 后，再除去上清液。（ 4 ）最后用丙酮洗涤肝浆， 再用布氏漏斗过滤， 或离心沉淀， 将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37 C烤干（过夜）。（ 5 ）在乳钵中充分研磨，用 120 目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干

5、燥保存。（二）透析法 荧光素如 FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透 析除去。（ 1 ）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。（ 2 ）浸入 0.02mol/pH7.17.4的PBS中（悬于大于标记物体积约 50100倍的PBS内），在4C中透析，每日更换34次PBS,约57天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。（三）葡聚糖凝胶 G-50 柱层析法除游离荧光素可用 2X46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体 1518ml （按床体 积的5%10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，

6、关闭下口，停留 30 40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱 液一定量后， 荧光抗体即向下移行， 逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入， 二者分离距离越来越大， 荧光抗体最先流出， 分前、中、后三部分收集， 测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20% 磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应） ， 继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+ 太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+

7、 ，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时， 即进行收集，之后出现 SO4+ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。最后是 NH4+ ，（用纳氏试剂 检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4+ 及 NH4+ 后可再用。如仅用小量荧光抗体， 可用 1X20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 23.5ml 荧光抗体。（四）DEAE 纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下：DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20 50mg 标记蛋白量

8、为宜 。常用梯度洗脱法如下：（1 ）层析柱用 0.01mol/L 、 pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L 、 pH7.2PB 洗脱，洗 出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS (0.05mol/L NaCI )洗脱部分 1。0.01mol/L、pH7.2PBS (0.01mol/L NaCl )洗脱部分 2。0.01mol/L 、 pH7.2PBS (0.02mol/L NaCl ) 洗脱部分 3。将此三部分收集液（每管 5ml ）分别测定其 F/P 比值， 0.05

9、mol/L NaCl pH7.2PB 洗脱液 280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。 其他两部分可以废弃。（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl 的浓度至2.0mol/L 洗脱完。经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失 50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大， 则可将荧光抗体稀释至一临界浓度， 使特异性染色呈阳性， 而使非特异性染色保持阴性， 稀释方法和染色效

10、价测定方 法相同。（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术 （免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。（七）纯化抗体法 - 免疫吸收法例如抗IgA血清的纯化方法 免疫吸收法。如分泌型 IgA （ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血 清常与 IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：1人 IgG 聚合物的制备在 5ml 含 40mg/ml 人 IgG 的 0.1mol/L pH7.0 磷酸缓冲溶液中，加入 2.5% 戊二醛溶液 1ml ，边加边搅， 5min 即出现混浊，逐

11、现大块胶块，放置 30min 后，用研 钵将凝胶磨细，继用 1.0mol/L pH7.0 磷酸缓冲溶液反复洗涤 3 次，末次加蒸馏水至 20ml ，即为 人 IgG 聚合物悬液。2 免疫吸收法将待吸收的抗 SIgG 血清加入待量 IgG 聚合物悬液，置室温搅拌 60min, 离心沉淀，上清液即稀释 1 倍的纯化抗 SIgA 血清。如用 IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。（八）伊文氏蓝（ Evans blue ）衬染法用 0.01% 伊文氏蓝的 0.01mol/L pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧 光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比， 减少了非特异性荧光

12、， 宜作常规应用。伊文氏蓝一般 先配成1%溶液，保存于 4 C,用前再稀释至 0.01%用以 和然释荧光抗体。此外，还可以用胰酶消化组织切片或用 10% 牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异 性染色。一、非特异性染色的识别常出现在组织边缘、 胶原纤维及血浆渗出处， 坏死组织及固定不良的组织中心处。 表现为弥漫性， 均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。二、非特异性染色的原因1. Ig 与 Fc 受体结合 多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此 Fc 受体的干扰基本不存在。由于福尔

13、马林固定破坏 了大部分的 Fc 受体，所以石蜡切片不多见。避免方法： 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片； 用不含 Fc 段的抗体，但价格贵（ V 区， C1 区不含 Fc 段，用 Pepsin 消化）2静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。避免方法： 尽量稀释一抗 降低抗体的电荷，如用 2.5%NaCl ， 0.05mTBS 代替 PBS； 用去垢剂 如 triton-100 处理切片。 Tween-20 等；3. 二抗与组织中的 Ig 结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人） Ig 发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越 明显，如人与猴，兔与豚

14、鼠。避免方法：用与待测组织相同的 5% 的正常血清稀释二抗。如人血清。Ig 结合4 组织中残存醛基与 Ig 的结合 如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和 避免方法：彻底冲洗； 0.02% 的新鲜的硼氧化钾液处理 10 分钟后冲洗；5内源性过氧化物酶 红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。避免方法： 石蜡切片 0.3% 双氧水 - 甲醇溶液处理切片； 冰冻切片 3% 双氧水处理切片 5 分钟（ 99： 1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏； 对于骨髓涂片最好用非过氧化物酶标记的抗体如碱性磷酸酶（ AP）J磷酸萘酯+水-a萘酚+偶氮染料J快兰 （fast blue） 或快红 （fast red）JJ兰色 红色用明胶甘油