动物细胞融合与单克隆抗体2

1、2.2 动物细胞工程选修3 现代生物科技专题 专题2 细胞工程教学目标重点难点问题探讨教学过程知识结构教学反馈课后习题教学参考2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体教学目标教学目标n了解动物细胞融合的原理、过程和意义。n理解单克隆抗体制备的过程和应用重点难点重点难点n1.教学重点： 单克隆抗体的制备和应用n2.教学难点： 单克隆抗体的制备过程 问题探讨问题探讨 “番茄马铃薯”（理想图） 通过长期的实验，科学家们通过长期的实验，科学家们采用体细胞杂交技术获得了采用体细胞杂交技术获得了“番番茄茄马铃薯马铃薯”植株。植株。如果将奶牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出

2、牛奶吗？动物细胞也能融合吗？教学过程教学过程一一.动物细胞融合动物细胞融合1.动物融合的过程请同学们阅读课本P52动物融合灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂交细胞细胞融合，形成杂交细胞（细胞膜具有一定的流动性）（细胞膜具有一定的流动性） 动物细胞融合过程示意图动物细胞融合过程示意图不同DNA的两个细胞 灭活的病毒有丝分裂两个完整的杂交细胞灭活病毒诱导细胞融合的原理：n病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞

3、发生融合。n灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏这些病原体的抗原结构。思考题思考题1.1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？ 酶解法，如纤维素酶或果胶酶酶解法，如纤维素酶或果胶酶2.2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？无需，因为动物细胞无细胞壁无需，因为动物细胞无细胞壁3.3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、电激等物理方法；离心、电激等物理方法；PEGPEG等化学方法等化学方法4.4.动物细胞融合

4、能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能能 还可以利用灭活的病毒进行诱导还可以利用灭活的病毒进行诱导5.5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能不能7.7.你推测一下动物细胞融合有哪些方面的应用吗？你推测一下动物细胞融合有哪些方面的应用吗？思考题思考题 利用动物细胞融合技术诱导形成杂交瘤细胞利用动物细胞融合技术诱导形成杂交瘤细胞8.8.在生产实际中杂交瘤细胞有怎样的

5、应用？在生产实际中杂交瘤细胞有怎样的应用？ 生产单克隆抗体生产单克隆抗体6.6.你能归纳出什么叫做动物细胞融合吗？你能归纳出什么叫做动物细胞融合吗？9.9.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。科间、动植物之间）成为可能。植物细胞杂交与动物细胞融合的比较植物细胞杂交与动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理融合前处理融合前处理诱导方法诱导方法主要用途主要用途细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性细胞的全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性 物

6、理方法物理方法（离心、振荡、电激）离心、振荡、电激） 化学方法（化学方法（PEG）物理、化学方法物理、化学方法灭活的病毒灭活的病毒获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后使细胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法从从血血清清中中分分离离抗抗体体多多种种效效应应B细细胞胞动动物物体体内内多多种种抗抗体体抗抗原原 提问？1.1.抗体是由何种细胞产生的？抗体是由何种细胞产生的？ 效应效应B B细胞（浆细胞）细胞（浆细胞）。2.2.一个淋巴细胞一个淋巴细胞( (浆细胞浆细胞) )能分泌多种抗体

7、吗？能分泌多种抗体吗？ 每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。3.3.一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？一种吗？ 动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。4. 4. 简述获得抗体的传统途径？简述获得抗体的传统途径？ 抗原抗原 动物体动物体 抗体抗体 抗原不纯抗原不纯 抗体不纯抗体不纯单克隆抗体单克隆抗体刺激浆细胞6.6.如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？

8、体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体7.7.体外培养淋巴细胞能无限增殖吗体外培养淋巴细胞能无限增殖吗? ?怎样解决这个问题？怎样解决这个问题？5.5.这种方法获得的抗体有什么缺陷？这种方法获得的抗体有什么缺陷？ 产量低，纯度低，特异性差产量低，纯度低，特异性差1.设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖二、单克隆抗体二、单克隆抗体2.制备过程：为什么给小鼠注射特定的为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？抗原蛋白？ 会有几种融合方式？会有几种融合方式？ 杂交瘤细胞是如何筛选出

9、杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有何特点？来的？有何特点？ 是否所有的杂交瘤细胞都是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？能产生专一性抗体？ 如何大规模进行培养得到如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？大量的单克隆抗体？BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）（一选）（一选）用用特定的选择特定的选择培养基筛选培养基筛选出多种杂交出多种杂交瘤细胞瘤细胞获得产生相应获得产生相应抗体的抗体的B B细胞细胞（二选）（二选）（克隆化（克隆化培养和抗体检测）培养和抗体检测）：筛选出能产生所需筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。抗体的杂交瘤细胞。如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行

10、杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞抗体的细胞，通常用，通常用“有限稀释法有限稀释法”来选择。将杂交瘤来选择。将杂交瘤细胞稀释，用细胞稀释，用多孔细胞培养板多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞检测各孔上清液中细胞分泌的抗体分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液那些

11、上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行行有限稀释，一般需进行3 34 4次，直至确信每个孔中增次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。化培养。 在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个细胞的情况下，培养得到的细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体杂交瘤细

12、胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的隆抗体。这里的单克隆单克隆确有确有单个细胞克隆单个细胞克隆的含义，只不过的含义，只不过克隆的克隆的不是不是B B淋巴细胞，而淋巴细胞，而是杂交瘤细胞是杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。专一抗体。免疫小鼠培养骨髓瘤细胞融合骨髓瘤细胞B淋巴细胞注射特定抗原蛋白选择培养基上培养专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性注射到小鼠体内体外培养单克隆抗体单克隆抗体克隆杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞 单克隆抗体制备过程示

13、意图单克隆抗体制备过程示意图多种杂交细胞（三）（三）单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，单克隆抗体特异性强，灵敏度高灵敏度高，并，并可大量制备可大量制备。应用主要有：应用主要有：1 1、作为诊断试剂、作为诊断试剂2 2、用于、用于治疗疾病治疗疾病和运载药物和运载药物准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速 把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合，制成制成“生物导弹生物导弹”。用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，灵敏度很高，在妊娠第8天就可以做出诊断，比原来的诊断方法提前了10天左右，可

14、以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90以上。知识结构两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势教学反馈1.动物细胞融合技术最重要的用途是 （ ）A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体C.培育新物种 D.生产杂种细胞B2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（ ）A.B淋巴细胞 B.T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D.杂交瘤细胞 D3.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是（ ）A.效应B细

15、胞 BT淋巴细胞C.骨髓瘤细胞 D杂交瘤细胞 A B C DB B体外培养体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案制备单克隆抗体不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞。(1).该实验方案的目的是：_(2).该方案能达到预期效果吗？为什么？(3).A是从小鼠的脾脏中取得_ 该细胞能够产生_ 。(4).图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。(5).C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个阶段，其中_代以内

16、的的细胞属于细胞株。B淋巴细胞抗体细胞融合灭活的病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50课后习题课后习题1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （ ）淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞A. B.C. D. C2.动物细胞融合和植物原生质融合决定于 ( )A.细胞膜的流动性 B细胞膜的选择透过性C.细胞质的流动性D细胞质酶的活性 A一.选择题3.“生物导弹”是指 （ ）A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单克隆抗体上连接抗癌药

17、物 D4.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 （ ）APEG B灭活的病毒 C电刺激 D离心A二.简答题1.淋巴细胞是由动物体-中的-细胞分化发育而来的。2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-骨髓造血干主动运输三.思考与探究1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。接融合。 提示：哺

18、乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞 能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。 教学参考教学参考1.已成功的动物细胞融合实例还有哪些？ 生物种类 细胞来源 成功年代 酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1975年人胡萝卜 腹水癌细胞原生质体 1976年人小鼠 纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞 1978年要知道更多的实例，需经常查阅更多科研报道。2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？ 就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的