生物化学实验--Folin-Wu法定量测定

1、Folin-WuFolin-Wu法法定量测定血糖的含量定量测定血糖的含量1.1.氧化供能氧化供能 2.2.人体的主要组成成分之一人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等脂肪和某些非必需氨基酸等3.3.糖代谢紊乱糖代谢紊乱供能障碍供能障碍一系列代谢变化一系列代谢变化 血糖：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：血糖总维持在恒定水平：3.93.96.7mmol/L6.7mmol/L 临床：临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的血

2、糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。主要依据。科研：科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。药物的研究中，也涉及血糖的测定。v调节血糖水平的激素：调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。v血糖水平异常：血糖水平异常：高血糖及糖尿病；高血糖及糖尿病；低血糖低血糖 指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时

3、伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。 症状随机血浆葡萄糖症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L, 11.1mmol/L,或空腹或空腹血浆葡萄糖血浆葡萄糖 7.0mmol/L 7.0mmol/L。症状不典型者需另。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是糖尿病典型的症状是“三多一少三多一少”，即多饮即多饮、多尿、多食及消瘦多尿、多食及消瘦测定测定方法方法酶法：酶法：（1 1）己糖激酶法（）己糖激酶法（HKHK）（

4、2 2）葡萄糖氧化酶法（）葡萄糖氧化酶法（GODGOD法）法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化适用于自动化分析，为葡萄糖测定的分析，为葡萄糖测定的参考方法参考方法，但是试剂较贵但是试剂较贵无机化学法：无机化学法： Folin-WuFolin-Wu法，特异性差法，特异性差有机化学法：有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多干扰因素多 掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。 学会制备无蛋白血滤液。 掌握7200型可见分光光度计的使用方法。葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，葡萄糖是一种多羟

5、基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基基，CuCu2+2+即被葡萄糖还原成即被葡萄糖还原成CuCu+ +（CuCu2 2O O）而沉淀。）而沉淀。 Cu Cu2+2+( CuSO( CuSO4 4 )+)+葡萄糖葡萄糖 Cu Cu+ + （CuCu2 2O O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, , CuCu2 2O O又把酸性钼酸试剂（又把酸性钼酸试剂（MoMo6+6+）还原成低价的蓝色钼化合）还原成低价的蓝色钼化合物物钼蓝钼蓝 。Cu

6、Cu2 2O+O+酸性钼酸试剂酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物蓝色钼化合物 OD OD420420比色比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的血滤液中葡萄糖的含量与产生的CuCu2 2O O成正比，而成正比，而CuCu2 2O O的量的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。1 1、25mL25mL血糖管血糖管3 3支；支；2 2、血糖管橡胶塞、血糖管橡胶塞3 3个；个；3 3、沸水浴小锅沸水浴小锅1 1个个； 4 4、100mL100mL锥形瓶锥形瓶2 2个；个；5 5、电炉、电炉1 1个；个；6 6、滤纸、滤纸1 1盒；盒；7 7、吸耳球、

7、吸耳球2 2个；个； 8 8、72007200型分光光度计型分光光度计1 1台台; ;血糖管血糖管7200型分光光度计型分光光度计 1 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%(1)1%葡萄糖母液：称取葡萄糖母液：称取1.000g1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml100ml。(2)(2)葡萄糖标准液：取葡萄糖标准液：取1.0ml1.0ml葡萄糖母液于葡萄糖母液于100ml100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。容量瓶中，加蒸馏水定容。2 2、10%10%钨酸钠溶液：钨酸钠溶液：称取钨酸钠称取钨酸钠10g10

8、g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100100毫升。毫升。3 3、0.33mol/LH0.33mol/LH2 2SOSO4 4溶液：溶液：于于53ml53ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入1ml1ml的浓硫酸。的浓硫酸。4 4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A A液：无水碳酸钠液：无水碳酸钠35g35g，酒石酸钠，酒石酸钠13g13g及碳酸氢钠及碳酸氢钠11g11g溶于蒸馏水，稀释溶于蒸馏水，稀释定容至定容至1000ml.1000ml. B B液：硫酸铜晶体液：硫酸铜晶体5g5g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100ml100ml。 临用时，临用时，A A液：液：B B液液=9=9

9、：1 1混合（体积比），混合液于冰箱中保存混合（体积比），混合液于冰箱中保存（44）。）。 5 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠称取钼酸钠600g,600g,用少量蒸馏水溶解后倾入用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 2000ml 的容量瓶中，加蒸的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml0.5ml，摇匀，摇匀，静止数小时后取上清夜静止数小时后取上清夜500ml500ml，于，于1000ml1000ml容量瓶中，徐徐加入容量瓶中，徐徐加入225ml85%225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加磷酸，边加

10、边摇匀，再加25%25%硫酸硫酸150ml150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%99%醋酸醋酸75ml75ml，摇匀，摇匀，用蒸馏水稀释定容至用蒸馏水稀释定容至1000ml,1000ml,贮于棕色瓶中。贮于棕色瓶中。 1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备： 用用5ml5ml移液管移液管吸取全血（已加抗凝剂）吸取全血（已加抗凝剂）1ml,1ml,缓缓缓缓放入放入100ml100ml锥形瓶中，加蒸馏水锥形瓶中，加蒸馏水7ml7ml，摇匀，溶血后（血，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加液变为红色透明）加10%10%钨酸钠钨酸钠1m

11、l1ml，摇匀，摇匀. .。 再加再加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41ml1ml，边加边摇，加毕充分摇匀，边加边摇，加毕充分摇匀，放置放置5 51515分钟，至沉淀变为分钟，至沉淀变为暗棕色暗棕色（如不变色可再（如不变色可再加加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41-21-2滴）。滴）。 用用干滤纸干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于液相当于1/10ml1/10ml全血。全血。2 2、血糖的定量测

12、定：、血糖的定量测定： 取取25ml25ml的血糖管的血糖管3 3支，编号。第一支血糖管中加入支，编号。第一支血糖管中加入2ml2ml蒸馏水蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加（空白管）；第二支血糖管中加2ml2ml标准葡萄糖液；用吸管标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液吸取无蛋白血滤液2ml2ml，放入第三支血糖管中。，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入然后向三支血糖管中各加入2ml2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中同时置于沸水浴中8 8分钟，取出，在流水中迅速冷却后分钟，取出，在流水中迅速冷却后, ,勿摇勿摇动动，各加，各加4ml4ml酸性钼酸

13、盐溶液。酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，用，混匀，用72007200分光光度计分光光度计在在420nm420nm波长处比色，以空白管调节零点。波长处比色，以空白管调节零点。按下式计算按下式计算100ml100ml全血中所含血糖的含量全血中所含血糖的含量m=Am=A1 1/A/A0 0C C0 00.1100100式中式中: : m m=100ml=100ml全血中含血糖毫克数全血中含血糖毫克数 ; ; C C0 0= =标准液葡萄糖含量标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml0.1mg/ml）；A A1 1= =样品液光吸收值样品液光吸收值

14、; ; A A0 0= =标准液光吸收值标准液光吸收值 0.10.1：1ml1ml无蛋白血溶液相对于无蛋白血溶液相对于0.1ml0.1ml全血全血 实验过程中那些操作可能影响实验结果的实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？准确性？ 实验中，血糖管有什么作用？实验中，血糖管有什么作用？ 实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？性硫酸铜液反应后的血糖管？1.1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度

15、时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入入1010硫酸硫酸1-21-2滴，待暗棕色后再过滤。滴，待暗棕色后再过滤。3.3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。 1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水蒸馏水7ml 7ml 摇匀摇匀 10%10%钨酸钠钨

16、酸钠1ml 1ml 摇匀摇匀 0.33mol/L 0.33mol/L H H2 2SOSO4 41ml 1ml 边加边摇边加边摇, ,加毕充分摇匀加毕充分摇匀 放置放置515分分(沉淀变为暗棕色沉淀变为暗棕色)(如不变色如不变色,再加再加0.33mol/L H2SO412滴滴 )干滤纸过滤干滤纸过滤 无蛋白血滤液无蛋白血滤液( (每毫升相当于每毫升相当于1/10ml1/10ml全血全血) )20ml20ml锥形瓶锥形瓶溶血溶血( (变为红色透明变为红色透明) )用用5ml5ml移液管移液管取全血取全血1ml1ml（已加抗凝剂（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：m=OD1/OD2

17、C 10 100朗伯定律朗伯定律：A=kA=k1 1L L 比尔定律比尔定律：A=kA=k2 2C C朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律：如同时考虑液：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成浓度和溶液的厚度的乘积成正比。正比。 A=KLC A=KLC A A标标=KC=KC标标L LA A样样=KC=KC样样L L 标准品法测定未知样品含量标准品法测定未知样品含量C C样样=A A样样A A标标C C标标连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接

18、通电源，使仪器预热接通电源，使仪器预热2020分钟。分钟。用用键设置测试方式：投射比（键设置测试方式：投射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知标准样品浓度值方式（已知标准样品浓度值方式（C C）和已知标准样品斜率（）和已知标准样品斜率（F F）方式。方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。 将参比样品溶液和被测样将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。在第二个槽位中。 将将0 0T T校具（黑体）置入校具（黑体）置入光路中，在光路中，在T T方式下按方式下按“0“0T”T”键，此时显示器显示键，此时显示器显示“000.0”“000.0” 按按 MODE MODE键选择键选择A A模式模式 将参比样品拉入光路中，将参比样品拉入光路中，按按“0A/100“0A/100T”T”键调键调0A/1000