化妆品的微生物学检查

1、第八章第八章化妆品的微生物学检查化妆品的微生物学检查1n化妆品的卫生标准化妆品的卫生标准n化妆品微生物学检查基础知识化妆品微生物学检查基础知识n化妆品中微生物总数检查化妆品中微生物总数检查n化妆品中控制菌检查化妆品中控制菌检查2一、一、2007版版“化妆品卫生规范化妆品卫生规范”粘膜用、粘膜用、婴儿及婴儿及儿童用儿童用化妆品化妆品眼部及口唇等眼部及口唇等细菌菌落总数细菌菌落总数不得大于不得大于500CFU/mL 或或500CFU/g。其他化其他化妆品妆品细菌菌落总数细菌菌落总数不得大于不得大于1000CFU/mL 或或1000CFU/g3所有化妆品所有化妆品霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌总数总数不得

2、大于不得大于100CFU100CFUmL mL 或或100CFU100CFUg g每克或每毫升产每克或每毫升产品中不得检出品中不得检出粪粪大肠菌群大肠菌群、铜绿铜绿假单胞菌假单胞菌和和金黄金黄色葡萄球菌色葡萄球菌。4二、检查的必备知识二、检查的必备知识n1.1.采样采样n采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样采样应具有代表性。从两个包装单位以上的样品中共取品中共取10g 10g 或或10mL10mL作为检验量。作为检验量。n样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有样品应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。n接到样品

3、后，应立即登记，编写检验序号，并接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在按检验要求尽快检验。及时检验的样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。5二、检查的必备知识二、检查的必备知识n1.1.采样采样n若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化若样品需同时做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。剩余样品做其它分析。n在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器束，

4、均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。行。6二、检查的必备知识二、检查的必备知识n1.1.采样采样n如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。之日起该菌种及被检样品应保存一个月。7二、检查的必备知识二、检查的必备知识n2.2.供检样品（供试品）的制备供检样品（供试品）的制备n水溶性液体样品水溶性液体样品样品样品10mL10mL90mL90mL生生理盐水理盐水1:

5、101:10供试液供试液8二、检查的必备知识二、检查的必备知识n2.2.供检样品（供试品）的制备供检样品（供试品）的制备n油性液体样品油性液体样品5mL5mL灭菌液灭菌液体石蜡体石蜡1:101:10供试液供试液均质器均质器10mL10mL灭灭菌吐温菌吐温80804044404410mL样品样品混匀混匀10min10min75mL 404475mL 4044灭菌生理盐水灭菌生理盐水40444044乳化乳化9二、检查的必备知识二、检查的必备知识n2.2.供检样品（供试品）的制备供检样品（供试品）的制备n亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品亲水性半固体（膏、霜、乳剂）样品振荡振荡90mL90mL生理生理

6、盐水盐水上清液作为上清液作为1:101:10供试液供试液10g样品样品15min15min膏、霜剂若用均膏、霜剂若用均质器，混合均质质器，混合均质12min12min即可。即可。10二、检查的必备知识二、检查的必备知识n2.2.供检样品（供试品）的制备供检样品（供试品）的制备n疏水性半固体样品疏水性半固体样品10mL10mL灭菌液灭菌液体石蜡体石蜡1:101:10供试液供试液均质器均质器10mL10mL灭灭菌吐温菌吐温80804044404410g样品样品混匀混匀10min10min70mL 404470mL 4044灭菌生理盐水灭菌生理盐水40444044乳化乳化膏、霜剂若用均膏、霜剂若用均

7、质器，混合均质质器，混合均质35min35min即可。即可。11二、检查的必备知识二、检查的必备知识n2.2.供检样品（供试品）的制备供检样品（供试品）的制备n固体样品固体样品振荡振荡90mL90mL生理生理盐水盐水上清液作为上清液作为1:101:10供试液供试液10g样品样品15min15min12三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查n1.1.意义意义n测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌测定总数主要是作为判定化妆品被细菌、霉菌及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品及酵母菌污染程度的标记，也可以观察化妆品中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆品中的中细菌、霉菌及酵母菌的性质和在化妆

8、品中的繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供繁殖动态，以便对样品进行卫生学评价时提供科学依据。科学依据。13三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查2.2.培养基、培养温度和时间培养基、培养温度和时间检查菌检查菌培养基名称培养基名称培养温度培养温度培养时间培养时间细菌细菌卵磷脂、吐温卵磷脂、吐温80-80-营养肉汤琼脂营养肉汤琼脂36361 148h48h2h2h真菌真菌虎红琼脂虎红琼脂28282 272h72h2h2h14三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查3.3.方法平皿法方法平皿法数据数据处理处理混合平板混合平板的制备的制备细菌、真细菌、真菌的培养菌的培养检查结果、检查结果

9、、观察与计数观察与计数供试液供试液的制备的制备书写检验书写检验记录单记录单15 细菌、霉菌和酵母菌计数的操作过程1010-1-11010-2-21010-2-21010-1-11010-1-11010-2-21010-2-2 1010-1-1对照对照对照对照对照对照对照对照1.0ml1.0ml倒置培养倒置培养48h48h1h1h363611卵磷脂、吐卵磷脂、吐温温80-80-营养肉汤琼营养肉汤琼脂脂282822虎红琼脂虎红琼脂倒置培养倒置培养72h72h2h2h9.0ml9.0ml 稀释液稀释液10g/10g/mlml供供试品试品 9.0ml9.0ml1010-2-21010-1-11.0ml

10、1.0ml16三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查4.4.操作注意事项操作注意事项1.1.尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。 2.2.为防止细菌增殖及产生菌苔，制为防止细菌增殖及产生菌苔，制成供试液后，应尽快稀释，注皿。成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在一般稀释后应在1 1小时内操作完毕。小时内操作完毕。 17三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查4.4.操作注意事项操作注意事项3.3.使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不使用吸量管时，应小心沿管壁加入，不用触

11、及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附用触及管内溶液，以防吸管尖端外侧黏附的溶液混入其中。的溶液混入其中。 4.4.注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。遇此情况应重复检验，以确定是防大。遇此情况应重复检验，以确定是防腐剂影响还是操作技术误差。腐剂影响还是操作技术误差。 18三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查4.4.操作注意事项操作注意事项5.5.为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，为检查和控制灭菌效果，应做空白对照，以检

12、验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过以检验所使用的物品是否彻底灭菌及检验过程是否无菌操作。程是否无菌操作。 6.6.为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每可在每100mL 100mL 卵磷脂吐温卵磷脂吐温80 80 营养琼脂中营养琼脂中加入加入1mL0.51mL0.5的的TTC TTC 溶液，如有细菌存溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。粒颜色无变化。19三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查5.5.菌落计数及报告方法菌落计数及报告方法 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数宜选取细菌、酵母菌平均菌落数30

13、30030300之间、霉菌平均之间、霉菌平均菌落数菌落数550550之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。的依据。 （1 1）当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数以该平皿菌落数乘其稀释倍数; ; （2 2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在若有两个稀释度，其平均菌落数均在30 30 个个300 300 个个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于等于2 2，应报告其平均数，若大于，应报告其平均数

14、，若大于 2 2 则报告其中稀释度较低则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数的平皿的菌落数20三、细菌、真菌总数检查三、细菌、真菌总数检查5.5.菌落计数及报告方法菌落计数及报告方法 （3 3）若所有稀释度的平均菌落数均大于若所有稀释度的平均菌落数均大于300 300 个，则应按稀个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之; ; （4 4）若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于30 30 个，则应按稀释个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之; ; （5 5）若所有稀释度的平均菌落数均

15、不在）若所有稀释度的平均菌落数均不在30 30 300 300 个之间，个之间，其中一个稀释度大于其中一个稀释度大于300 300 个，而相邻的另一稀释度小于个，而相邻的另一稀释度小于30 30 个时，个时，则以接近则以接近30 30 或或300 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；的平均菌落数乘以稀释倍数报告之； （6 6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g g 或每或每mL mL 小于小于10CFU;10CFU;21例次例次 不同稀释度平均菌落数不同稀释度平均菌落数 两稀释度两稀释度菌数之比菌数之比菌落总数菌落总数(CFU/mL(CFU/mL或

16、或CFU/g)CFU/g)报告方式报告方式(CFU/mL (CFU/mL 或或CFU/gCFU/g)1010-1 -11010-2 -21010-3 -31 1136513651641642020- -16400164001600016000或或1.61.6* *10104 42 22760276029529546461.61.638000380003800038000或或3.83.8* *10104 43 32890289027127160602.22.227100271002710027100或或2.72.7* *10104 44 4不可计不可计46504650513513- -51300

17、0513000513000513000或或5.15.1* *10105 55 5272711115 5- -270270270270或或2.72.7* *10102 26 6不可计不可计3053051212- -30500305003100031000或或3.13.1* *10104 47 70 00 00 0- -11* *101022四、控制菌检查四、控制菌检查检查项目检查项目（1 1）阴性对照阴性对照试验：应无菌生长。试验：应无菌生长。（2 2）阳性对照阳性对照试验：供试品试验：供试品+ +阳性对照菌，阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。应检出相应的阳性对照菌。 （3 3）供试品供试品控

18、制菌检查：依相应的检查方控制菌检查：依相应的检查方法进行。法进行。 23四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程供试品供试品增菌培养增菌培养分离培养分离培养纯培养纯培养染色镜检染色镜检生化反应试验生化反应试验报告结果报告结果24四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程1.1.增菌培增菌培养目的养目的使被检药物中使被检药物中的被检菌增殖，的被检菌增殖，避免出现漏检。避免出现漏检。25四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程2.2.分离培分离培养目的养目的经增殖培养后经增殖培养后,被检菌大被检菌大量繁殖，同时其他一些量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此杂菌也出现增殖。因此分离培养能

19、使目的菌从分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。混合菌中分离出来。26四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程3.3.纯培养纯培养目的目的只是大量增殖被检菌，只是大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。用于后面的进一步检验。27四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程4.4.染色镜染色镜检目的检目的初步鉴定，观察细菌的初步鉴定，观察细菌的形态大小。形态大小。28四、控制菌检查四、控制菌检查检查流程检查流程5.5.生化试生化试验目的验目的最终的鉴定依据，最终的鉴定依据，结合染色镜检得出结合染色镜检得出实验结果，填写检实验结果，填写检验报告。验报告。29四、控制菌检查四、控制菌检查粪大肠菌群

20、检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群粪大肠菌群 粪大肠菌群系一群需氧及粪大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧兼性厌氧革兰氏阴性革兰氏阴性无芽胞杆无芽胞杆菌，在菌，在44.544.50.50.5培养培养24h24h48h 48h 能发酵乳糖能发酵乳糖产酸并产气产酸并产气。30四、控制菌检查四、控制菌检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群检查意义粪大肠菌群检查意义 粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产随粪便排出体外后可直接污染化妆品，若产品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，品中检出该菌群，表明该产品受到粪便污染，可能存在肠道致病菌并

21、引起疾病，是评价化可能存在肠道致病菌并引起疾病，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。妆品卫生质量的重要指标之一。31四、控制菌检查四、控制菌检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群检查产酸：黄色产酸：黄色产气：气泡产气：气泡产酸产气产酸产气书写检验书写检验记录单记录单不产酸不产气不产酸不产气增增菌菌培培养养供试供试液的液的制备制备配培配培养基养基和稀和稀释液释液检查检查结果结果判断判断44 44 0.50.52428h2428h分离培养分离培养蛋白胨水蛋白胨水培养培养最终结最终结果判断果判断44 44 0.50.524242h2h靛基质靛基质特特征征菌菌落落36361 1 1824h1824h双倍胆盐乳糖

22、双倍胆盐乳糖MMEMBEMB琼脂琼脂液面玫瑰红色液面玫瑰红色紫黑色紫黑色粪大肠菌群检查流程图粪大肠菌群检查流程图32双倍乳糖胆盐培养基双倍乳糖胆盐培养基EMB琼脂培养基琼脂培养基靛基质试验靛基质试验气泡，气泡，培养基培养基呈黄色呈黄色紫黑色紫黑色金属光金属光泽泽玫瑰红玫瑰红色液面色液面33四、控制菌检查四、控制菌检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群检查粪大肠菌群检查结果报告粪大肠菌群检查结果报告 根据发酵乳糖产酸产气，平板上有根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大

23、肠菌群。品中检出粪大肠菌群。34四、控制菌检查四、控制菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌属于假铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为单胞菌属，为革兰氏阴性革兰氏阴性杆菌，杆菌，氧化酶阳性氧化酶阳性，能产，能产生生绿脓菌素绿脓菌素。此外还能。此外还能液液化明胶化明胶，还原硝酸盐还原硝酸盐为亚为亚硝酸盐，在硝酸盐，在424211条件条件下能生长。下能生长。35四、控制菌检查四、控制菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查意义铜绿假单胞菌检查意义 铜绿假单胞菌在特殊情铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎

24、等。外泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。不得检出铜绿假单胞菌。36四、控制菌检查四、控制菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查最终结最终结果判断果判断增增菌菌培培养养供试供试液的液的制备制备书写检验书写检验记录单记录单分分离离纯纯化化无菌落或无特征菌落无菌落或无特征菌落配培配培养基养基和稀和稀释液释液革兰染色、镜检革兰染色、镜检 氧化酶试验氧化酶试验 绿脓菌素试验绿脓菌素试验生化试验生化试验 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 4242生长试验生

25、长试验 明胶液化试验明胶液化试验铜绿假单胞菌检查流程图铜绿假单胞菌检查流程图SCDLPSCDLP培养基培养基十六烷三甲基十六烷三甲基溴化铵琼脂溴化铵琼脂3636111824h1824h3636111824h1824h特征菌落特征菌落灰白色、扁灰白色、扁平、周围有平、周围有水溶性蓝绿水溶性蓝绿色素色素37十六烷三甲基溴化铵平板十六烷三甲基溴化铵平板SCDLP培养基培养基黄绿色黄绿色菌膜菌膜灰白色灰白色湿润湿润氧化酶试验氧化酶试验粉红粉红/紫红色紫红色38绿脓菌素试验绿脓菌素试验盐酸层呈粉紫色盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色氯仿层呈蓝绿色硝酸盐还原产气试验硝酸盐还原产气试验N2明胶液化明胶液化试验试验

26、明胶培养基（高层）明胶培养基（高层）明胶液化明胶液化39四、控制菌检查四、控制菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查铜绿假单胞菌检查结果报告铜绿假单胞菌检查结果报告 被检样品经增菌分离培养后，经证实为被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和硝酸盐还原产气和4242生长试验三者皆为阳生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。菌。40四、控制菌检查四、控制菌检查金黄色葡萄球菌检查金黄色葡萄球菌检查金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌为革兰氏革兰氏阳性球菌阳性球菌，呈葡萄状排列，无，呈