动物细胞培养和核移植技术课件

1、动物细胞培养和核移植技术2.2 动物细胞工程动物细胞工程2.2.1 动物细胞培养和核动物细胞培养和核移植技术移植技术动物细胞培养和核移植技术1.1.动物细胞培养的概念：动物细胞培养的概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织，将它离散成单个细胞。然后相关的组织，将它离散成单个细胞。然后, ,放放在适宜的培养基中，让这些细胞在体外生长在适宜的培养基中，让这些细胞在体外生长和增殖。和增殖。一、动物细胞培养一、动物细胞培养原理：细胞增殖动物细胞培养和核移植技术动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶机械机械剪碎剪碎单个细

2、胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬液悬液10代代细胞细胞部分细胞部分细胞“癌癌变变”，无限传代，无限传代50代细胞代细胞原代培养原代培养传代培养传代培养细胞贴壁细胞贴壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞细胞3.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：动物细胞培养和核移植技术4 细胞培养基本器械和要求细胞培养基本器械和要求动物细胞培养和核移植技术培养器皿动物细胞培养和核移植技术动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶机械机械剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬液悬液10代代细胞细胞部分细胞部分细胞“癌癌变变”，无限传代，无限传代50代细胞代细

3、胞原代培养原代培养传代培养传代培养细胞贴壁细胞贴壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞细胞3.动物细胞培养过程：动物细胞培养过程：动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养条件动物细胞培养条件1 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2 2、营养、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血浆等。浆等。）3 3、温度和、温度和PHPH 36.5 +0.5度 ；PH为7.2-7.4。4 4、气体环境：、气体环境： OO2 2和和COCO2 2（95%95%空气和空气和5% CO5%

4、CO2 2 ）补充合成培养基补充合成培养基中缺乏的物质中缺乏的物质动物细胞培养和核移植技术 注意关键词: 细胞贴壁细胞贴壁 接触抑制接触抑制 原代培养原代培养 传代培养传代培养动物细胞培养和核移植技术有关概念有关概念: : 原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。原代细胞。 传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，制成细胞悬浮液，分分装到两个或两个以上的装到两个或两个以上的培养培养瓶瓶中继续培养，称为传代培养。中继续培养，称为传代培养。动物细胞培养和核移植技术接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面

5、后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。思考题：思考题：1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。因为这些组织或器官，分裂能力旺盛，易于培养。(1)(1)成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖和增殖(2)(2)成块组织使细胞不能与培养液充分接触，不成块组织使细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。利于培养。3、胰蛋白酶的作用是什

6、么呢？由此可说明细胞间、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质白质( (胶原蛋白等胶原蛋白等) )。4、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能6 6、既然、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉胰蛋白酶能将细胞消化掉，那，那将动物将动物组织分散成单个细胞要组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间

7、的控制注意时间的控制 不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PHPH较接近较接近8、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？无毒？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖易于培养细胞贴壁，进行生长增殖动物细胞培养和核移植技术一、动物细胞培养一、动物细胞培养1、过程：、过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培

8、养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性植物体植物体培养结果培养结果或细胞产物或细胞产物快速繁殖快速繁殖、培育培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、葡萄糖、动动物血清物血清蔗糖、植物蔗糖、植物激素激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较细胞群体细胞群体动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养技术应用动

9、物细胞培养技术应用va、生产生物制品、生产生物制品vb、与基因工程相结合、与基因工程相结合vc、有毒物质的检测、有毒物质的检测 克隆就是克隆就是无性繁殖无性繁殖，具体地说，是指，具体地说，是指 一个共一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体分子、细胞或个体。a.分子水平上：分子水平上：b.细胞水平上：细胞水平上：c.个体水平上：个体水平上：1. 1. 什么是克隆？什么是克隆？一般指一般指DNA克隆。克隆。指一个单一的细胞分裂所形成的细胞群体。指一个单一的细胞分裂所形成的细胞群体。 指基因型完全相

10、同的两个或一个群体。指基因型完全相同的两个或一个群体。动物细胞培养和核移植技术动物细胞核移植技术和克隆动物动物细胞核移植技术和克隆动物v动物细胞核移植：动物细胞核移植：是将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞是将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分类：分类：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度低，恢复全能性容易 细胞分化程度高，恢复全能性困难细胞分化程度高，恢复全能性困难动物

11、细胞培养和核移植技术卵细胞卵细胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细胞融合后的卵细胞细胞拆合技术细胞拆合技术妊娠妊娠多莉羊的培育过程多莉羊的培育过程卵母卵母细胞细胞去核去核体细体细胞取胞取核核重组细胞重组细胞重组胚胎重组胚胎新个体新个体电激电激 使两细胞融合使两细胞融合或或核移植核移植M期期（减（减中）中）的卵母细胞的卵母细胞动物细胞培养和核移植技术显微操作仪显微操作仪动物细胞培养和核移植技术显微操作示意图显微操作示意图动物细胞培养和核移植技术动物细胞培

12、养和核移植技术（2）核供体细胞的准备）核供体细胞的准备在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球、体细胞、胚供体细胞主要有两大

13、类：胚胎卵裂球、体细胞、胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 动物细胞培养和核移植技术（3 3）细胞核移植）细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射是用一个外径明带下注射。胞质内注射是用一个外径58m 的注的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。合。 整个过程

14、用了哪些技术？整个过程用了哪些技术？细胞培养、核移植、胚胎移植细胞培养、核移植、胚胎移植 新生牛的性别、基因？新生牛的性别、基因？性别与供体相同、基因与供体性别与供体相同、基因与供体的基本相同的基本相同 繁殖方式？繁殖方式？无性繁殖无性繁殖 原理？原理？动物动物细胞核细胞核的全能性的全能性归纳归纳:1 1、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了供体动物进行了100%100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？ 克隆动物绝大部分克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，但来自供体细胞核，但核外还有少部分核外还有少部分DNADNA（如线粒

15、体（如线粒体DNADNA）来自受体卵）来自受体卵母细胞。母细胞。不是不是动物细胞培养和核移植技术1、卵母细胞为减数第二次分裂中期的次级卵、卵母细胞为减数第二次分裂中期的次级卵母细胞母细胞2、原因？、原因？细胞比较大，易操作细胞比较大，易操作细胞质中含有使体细胞核全能性表达细胞质中含有使体细胞核全能性表达出来的物质出来的物质3、克隆过程运用的技术手段？、克隆过程运用的技术手段？动物体细胞核移植、动物细胞培养和胚胎移植动物体细胞核移植、动物细胞培养和胚胎移植4、多利的大部分性状与谁一样？、多利的大部分性状与谁一样？白面绵羊白面绵羊5、结论？、结论？高度分化的体细胞核具有全能性高度分化的体细胞核具有

16、全能性动物细胞培养和核移植技术体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景 1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植动物细胞培养和核移植技术体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题 在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，

17、生产现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。 2 2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是细胞是 （ ） A A获得不死性的细胞获得不死性的细胞 B B1010代以内细胞代以内细胞 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞1 1、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是 （ ） A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养A AD D课堂反馈练习课堂反馈练习3

18、 3、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（ ）A A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白分泌蛋白B B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C C、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡、细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡 过程中过程中D D、培养至、培养至5050代后传代细胞遗传物质没有发生改变代后传代细胞遗传物质没有发生改变B B4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、 B B、 C C、 D D、