蛋白质分分离纯化和表征2010

1、会计学1蛋白质分分离纯化和表征蛋白质分分离纯化和表征2010一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有有两性解离性质两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的与溶液的pH有关，有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，升高，则解离情况相反。则解离情况相反。 等电点（等电点（pI）: 在特定在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零条件下，某种蛋白质分子所带正负电

2、荷相等，静电荷为零，这一，这一pH 称为该蛋白质的等电点（称为该蛋白质的等电点（pI）。）。几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点（一）根据化学组成测定最低相对分子量（一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。 例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计计 算二者的相对分子质量。算二者的相对分子质量。 最低相对分子量最低相对分子

3、量 x 100 =铁的百分含量铁的百分含量 铁的原子量铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。理计算蛋白质的最低分子量。 渗透压法测定渗透压法测定Mr操作简单，操作简单， Mr在在10-100 kDa时较准，但不能区别时较准，但不能区别蛋白质分子是否均一蛋白质分子是否均一 。 渗透压公式：渗透压公式： Mr =RTlimc0c(c=质量浓度，质量浓度，g/mol)渗透压法测定渗透压法测定Mr法的缺点：法的缺点：

4、不能确定溶液不能确定溶液蛋白质分子是否均一。蛋白质分子是否均一。 沉降速度法沉降速度法其中其中:S:是沉降系数是沉降系数D:是扩散系数是扩散系数:是溶剂的密度是溶剂的密度 v:是蛋白质的偏微分比容是蛋白质的偏微分比容。 将纯的分析样品放于离心池中，进行将纯的分析样品放于离心池中，进行 低速度长时间低速度长时间 离心，样品颗粒沉降形成浓度差，离心，样品颗粒沉降形成浓度差， 而扩散又使样品而扩散又使样品 颗粒由高浓度区向低浓度区扩散颗粒由高浓度区向低浓度区扩散, 最终达到沉降与扩最终达到沉降与扩 散的平衡状态。散的平衡状态。Mr = 2RTln(C2/C1)2(1V)(x22x12) 沉降平衡法沉

5、降平衡法蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的Ve Ve （VeVe为洗脱体积）为洗脱体积） ，并，并以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得作图得一直线，再测出待测样品的一直线，再测出待测样品的VeVe，查标准曲线即可确定分，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对子量，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出待作图得一直线，再测出待测样品的测样品的VeVe，查标准曲线即，查标准曲线即可确定分子量。可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测聚

6、丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100 nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。于水成为

7、稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： l 双电层双电层l 水化层水化层 a. 丁达尔效应丁达尔效应 b. 布朗运动布朗运动 c. 不能透过半透膜不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀三、胶体性质与蛋白质的沉淀2蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。这既是所

8、谓的蛋白质沉淀作用。 盐析法（盐析法（salting out） ： 中性盐（中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）等） 蛋白蛋白 质脱去水化层。质脱去水化层。 优点：不引起蛋白质变性。优点：不引起蛋白质变性。 盐溶（盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。加的现象。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水脱去水 化层以及降低介电常数化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相而增加带电质点间的相 互作用。互作用。 条件：低温操作，缩短时间。条件：低温操作，缩短时间。 重

9、金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：当溶液当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等) 生成沉淀。生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶当溶 液液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等) 生成沉淀。生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。能引起生物

10、碱沉淀的一类试剂。 当溶当溶 液液pHpI时时,蛋白质颗粒带正电荷蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂易与生物碱试剂, 酸根负离子反应酸根负离子反应沉淀沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质l 旋光值改变旋光值改变l 特性粘度增加特性粘度增加l 溶解度降低溶解度降低l 扩散系数降低扩散系数降低l 结晶能力丧失结晶能力丧失l 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点 则不一定沉淀则不一定沉淀l 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现变性后蛋白质的表现凝胶过滤法凝胶过滤

11、法 凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-C