蛋白质结晶学和X光衍射基础

1、会计学1蛋白质结晶学和蛋白质结晶学和X光衍射基础光衍射基础历史的回顾历史的回顾历史的回顾历史的回顾历史的回顾历史的回顾历史的回顾历史的回顾X 射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与 射线之间，约为射线之间，约为102 到到102 埃的范围。埃的范围。X光衍射原理光衍射原理X光衍射原理光衍射原理1.1. X X 射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是，在通常实验条件下，很难观察到，在

2、通常实验条件下，很难观察到X X 射线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有射线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的介质，的介质，X X 射线的折射率射线的折射率n n都很接近于都很接近于1 1（但小于（但小于1 1），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的程度。的程度。2.2. 在物质的微观结构中，原子和分子的距离（在物质的微观结构中，原子和分子的距离（1 1 10 10 埃左右）正好落在埃左右）正好落在X X 射线的波长范围内，射线的波长范围内，所以物质（特别是晶体）对所以物质（特别是晶体）对X X 射线的散射和衍射能够传递极为丰富的

3、微观结构信息。射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X X 射线衍射线衍射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。3.3. X X 射线穿透物质时都会被部分吸收射线穿透物质时都会被部分吸收, ,其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和厚度有关。在此过程中厚度有关。在此过程中X X 射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使气体电离；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使新键气体电离

4、；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使新键的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚至造成辐射损伤。至造成辐射损伤。4.4. X X 射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起X X 射线方向的改变，射线方向的改变， 不引起能量变化的散射不引起能量变化的散射，称为相干散射，这是，称为相干散射，这是X X 射线衍射的物理基础；另一种是既引起射线衍射的物理基础；另一种是既引起X X 射线光子方向改变，也引起射

5、线光子方向改变，也引起其能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲其能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲电子（光电子）。电子（光电子）。布拉格方程劳埃（Laue）方程 X X 射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是X X 射线被晶体散射的一种特殊表射线被晶体散射的一种特殊表现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当X X 射射线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，

6、会互相干涉，在一些特定的线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，会互相干涉，在一些特定的方向上互相加强，产生衍射线。方向上互相加强，产生衍射线。 晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分布排列的坐标。布排列的坐标。X光衍射原理光衍射原理劳埃（劳埃（LaueLaue）方程和布拉格（）方程和布拉格（BraggBragg）方程确定了衍射方向与晶体

7、结构基本周期的）方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的关系，通过对衍射方向的测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参关系，通过对衍射方向的测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参数。而数。而X X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的位置。位置。X光衍射原理光衍射原理挑战和机遇？Structural Biology ProcessesStructural Biology ProcessesRecombinant protein over-expression and Recombina

8、nt protein over-expression and purificationpurificationExpression systems:1. Bacteria system2. Yeast3. Insect cells4. Mammalian cells5. Cell-free system蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Some Vectors for E.coli Expression System蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Protein Expression in YeastCloning of target gene to vectorTransform to yea

9、st Pichia pastorisSelection of recombinant yeast strainYeast cell culture for protein production蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Protein Expression in Insect CellsAfter recombinationCloning of target gene to pFastBacTransform to bacteria with BacmidBacmid transfected to insect cellsVirus assembly in insect cellsViru

10、ses infect Insect Cells for protein productionStrains for expression: Sf9, Sf21, Hi5蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Transient Expression In Mammalian Cells293E cell can be cultured in suspension medium Recombinant plasmid with target geneTransfect to 293E cells with PEIHarvest cells for protein purification蛋白质表达、纯化

11、蛋白质表达、纯化293EBNA1 Cells With GFP Expressing VectorABA. Whole cells on plate; B. Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Recombinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells Lanes: 1. Protein standard; 2. Control whole 293E cells; 3. GFP expressed 293E cells; 4. HCF-1N380 ex

12、pressed 293E cells; 5. HCF-1N16-363 expressed 293E cells. Recombinant protein 1 (lane 4)1 2 3 4 5142031456794Recombinant protein 2 (lane 5)GFP (lane3)蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Cell-free System for Protein ProductionSometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellul

13、ar system.Roche: Rapid Translation System (RTS) Rapid protein expressionToxic protein expression蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化1. ProteinProtein Complex Expression and Purification: a. Proteins express separately; b. Proteins co-express in one cell.2. Protein-Nucleic Acid： a. Protein-DNA Complex； b. Protein-RNA Co

14、mplex.Producing Protein Complexes Producing Protein Complexes for Crystallizationfor Crystallization蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化ProteinProtein Complex Expression and Purification蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化ProteinProteinDNADNA ComplexComplex1. Protein solubility: higher in high salt buffer usually;2. Protein-DNA complex st

15、ability: more stable than protein alone;3. DNA length and sequence used for crystallization: a. additional base pairs; b. sticky ends;4. Purification of DNA oligos: HPLC with hydrophobic interaction, C4 etc;5. Trapping reaction intermediate: disulfide bridge; protein point mutation, etc;6. Preparati

16、on of protein-DNA complexes: mix with extra molar DNA;7. Crystallization: PEG or MPD in low slat buffer;8. Example: over 6000 trial for protein-DNA complex.蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Protein-RNA ComplexDifficulties: avoid of RNase! 1. Phosphate groups interfere crystal packing; 2. Elongated RNAs pack loosely;R

17、NA engineering: blunt or sticky ends; deletion, replacement, etc;RNA preparation: 1. Synthesis; 2. In vitro transcription;蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化Protein Modification for Crystallization1. Protein inhibitor, partner and monoclonal antibody;2. Protein post-translational modification;3. Protein mutagenesis: t

18、runcation, mutation, deletion蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化SDS-PAGENative-PAGE蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质表达、纯化蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶如何形成晶体？蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质结晶方法 整批结晶法 透析法 液液扩散法 气相扩散法蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白

19、质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶Precipitants used in macromolecular Precipitants used in macromolecular crystallizationcrystallization1. Salts: (NH4)2SO4 2. Volatile organic solvents: Ethanol3. Long chain polymers: PEG40004. Low molecular weight polymers and non-volatile organic compounds: MPDTable 3. P

20、recipitants used in macromolecular crystallizationFactors affecting crystallizationFactors affecting crystallization1. For macromolecule: purity, stability, modification, etc;2. Some chemical factors: pH, precipitant, ion strength, specific ions, etc;3. Some physical factors: temperature, crystalliz

21、ation method, time, etc.1. Homogeity: purity is very important;2. Solubility: dissolve protein to high concentration;3. Stability: maintain protein as stable as possible;4. Supersaturation: alter the properties of solution for supersaturation;5. Association: try to promote ordered association;6. Nuc

22、leation: try to promote the formation of nuclei;7. Variety: try as many methods as possible; 8. Liquid impurities: avoid impurities in the mother liquid;9. Preservation: protect plate and crystal from shock and disruption;Conclusions: some important principlesScreeningRoboticManual结 晶蛋白质的结晶蛋白质的结晶Cry

23、stalMation 蛋白质的结晶蛋白质的结晶四圆衍射仪四圆衍射仪DIP XDIP X射线面探测仪射线面探测仪CCD XCCD X射线检测仪射线检测仪ACTOR: Automated Crystal Transfer, Orientation and Retrieval蛋白质的结晶蛋白质的结晶Ultimate HomeLab 蛋白质的结晶蛋白质的结晶HighFlux HomeLab蛋白质的结晶蛋白质的结晶Compact HomeLab 蛋白质的结晶蛋白质的结晶衍射图片衍射图片电子密度电子密度三维结构三维结构H K L F Phi? phi相角求解相角求解实空间倒易空间 X射线衍射实验和结构计算

24、过程Fourier变换与Fourier反变换 公式二公式二 根据电子密度计算结构因子根据电子密度计算结构因子公式一公式一 根据结构因子计算电子密度根据结构因子计算电子密度公式三公式三 根据原子坐标计算结构因子根据原子坐标计算结构因子结构解析的数学原理结构解析的数学原理常用的蛋白质晶体学软件分类介绍相位确定中的软件应用结构可视化的软件应用结构描述中的软件应用Agenda数据处理中的软件应用总结Phasing and refinementVisualizationStructureDescriptionData ProcessingAutomar, DPS, HKL, Mosflm, novel_

25、R, Strategy, XDS, d*TREKAMoRe, ARP/wARP, CCP4, cctbx, CNS, CONVROT, EPMR, FFFEAR, MADSYS, MAID, MAPUTILS, MOLREP, OASIS2004, SHELX, SnB, SOLVE/RESOLVE, USF, X-plorO, COOT, QUANTA, XtalView Conscript, DINO, GRASP, LIGPLOT, MOLMOL, Molscript/Bobscript, MSMS, PROMOTIF, PyMOL, Provay, RASMOL, Raster3d,

26、Ribbons, Setor, SPOCK, TkRaster3d, TOPS, VMDRmergeCompletenessRedundancyI/sigma(I)System absence Peak SearchIndexParameter RefinementIntegrationMergeCheck output data 目前实验室现在比较常用的处理软件：目前实验室现在比较常用的处理软件：HKL2000/HKLHKL2000/HKL ： 是目前使用最为广泛的一种数据处理软件包； 在PDB库中有超过80的结构的数据是用HKL2000/HKL处理的； 操作界面清晰，使用方便； 在处理大部

27、分数据的时，Index和Integration较其他软件更有优势。对数据的评价标准：对数据的评价标准： 1. Rmerge : 越低数据质量越好，最高壳层的越低数据质量越好，最高壳层的Rmerge最好在最好在50%以下；以下； 2. 完整度完整度(Completeness) : 越大表明数据的完整性越好，最好各壳层的越大表明数据的完整性越好，最好各壳层的完整度都控制在完整度都控制在90%以上（有冰环的情况除外）；以上（有冰环的情况除外）； 3. 冗余度冗余度(Redundancy) : 越大则对密度图的细节贡献越明显，因此数越大则对密度图的细节贡献越明显，因此数据收集衍射图的张数越多越好；据收

28、集衍射图的张数越多越好； 4. 信躁比信躁比 (I/sigma(I) : 表明了衍射点的信号强度，越大数据质量越好，表明了衍射点的信号强度，越大数据质量越好，最高壳层不应低于最高壳层不应低于23； 5. 对于对于MAD数据，还要观察数据，还要观察Scale Factor随时间得变化，以确认波长是随时间得变化，以确认波长是否发生变化；否发生变化；对空间群的判断：对空间群的判断： 由于某些空间群的系统消光完全相同，或者两个不同空间群处理出晶由于某些空间群的系统消光完全相同，或者两个不同空间群处理出晶胞参数的某个值相差很小，都会造成判断上的失误，因此应注意及时调整胞参数的某个值相差很小，都会造成判断

29、上的失误，因此应注意及时调整空间群。空间群。 1. 分子置换法2.重原子法3. 直接法多(单)对同晶置换法（MIR/SIR)多(单)波长反常散射法 (MAD/SAD)MAD/SAD方法的软件方法的软件包包Heavy atom searchHeavy atom position refinementPhasingPhase improvement: Density modification NCS averaging Phase extendSHELXSOLVE/RESOLVECNS/X-plorSnBOASIS2004CCP4(Mlphare ) MAD/SAD主要流程主要流程SHELX (H

30、eavy atom search)SOLVE (Heavy atom position refinement)SOLVE (Phasing)RESOLVE (DM, NCS averaging, High resolution native )CNS(DM, NCS averaging, High resolution native )HKL2MAP, SHELXC/D, SOLVE/RESOVE, CNSElectron Density Map/Model building 几乎每种软件都包含了从几乎每种软件都包含了从Heavy atom search到到Phase improvement的

31、所有程的所有程序；但是各有侧重。序；但是各有侧重。对对MIR/SIR的数据处理方法与的数据处理方法与MAD/SAD方法类似。方法类似。对于一般的数据，可以首先选用对于一般的数据，可以首先选用SOLVE/RESOLVE进行初步计算。进行初步计算。经验总结：经验总结： 1. SHELX长于长于Heavy atom search； 2. SOLVE/RESOLVE简单、集成功能较多，方便使用，但简单、集成功能较多，方便使用，但DM的效果不的效果不是很好；是很好； 3. CNS长于长于Phase improvement，其其density modification, averaging的效果的效果明显

32、优于其他软件；明显优于其他软件；综合使用，取得最佳结果。综合使用，取得最佳结果。MR方法的软件包方法的软件包Cross_rotation searchTranslation searchCNS/X-plorMolrepAmoreEpmrPhaser MR主要流程主要流程常用的软件包 ： CNS和AmoreAmore的特点是界面操作，可建立模型库，计算速度较快，使用方便； CNS的特点是结果较为准确，可调整的参数多，但是速度较慢。1.数据准备 需要准备的文件包括： 数据文件 ：data.sca 模型的坐标文件 ：model.pdb2.数据转换 将数据转换成为CNS可用的格式： a. %to_cn

33、s data.sca data.hkl 将数据文件转化成为cns可用的hkl数据文件； b. %cns_solve structure_infile=;* coordinate file *= coordinate_infile=;= crystallographic data =* space group * use International Table conventions with subscripts substituted by parenthesis *= sg=;* unit cell parameters in Angstroms and degrees *+ table:

34、 rows=1 cell cols=6 a b c alpha beta gamma +* reflection file *= reflection_infile=“;= output files = rf_list_outfile=;% cns_solve structure_infile=;* coordinate file *= coordinate_infile=;= crystallographic data =* space group * use International Table conventions with subscripts substituted by par

35、enthesis *= sg=;* unit cell parameters in Angstroms and degrees *+ table: rows=1 cell cols=6 a b c alpha beta gamma +* reflection file *= reflection_infile=“;* rotation function list file *= rf_list_infile=;= output files = output_root=;% cns_solve translation.inp6. 检查平移函数的结果 theta1 theta2 theta3 tr

36、ansX transY transZ monitor packingR# 1 287.27 .01 72.73 .00 .00 -.01 .R# 2 141.32 .15 353.68 53.81 .06 -.06 R# 3 262.18 1.94 341.76 74.61 81.54 10.62 .136 .2881R# 4 29.24 .68 80.23 -17.12 63.25 14.13 .147 .2670R# 5 89.99 .01 .00 .01 -.01 .00 R# 6 113.87 1.37 102.09 -29.31 51.12 1.86 .137 .3336R# 7 3

37、23.92 52.85 311.97 45.64 55.51 2.93 .147 .2076R# 8 352.58 60.67 355.53 -40.19 7.59 -104.00 .126 .2706R# 9 18.58 17.33 19.77 -19.94 15.89 -114.21 .105 .2633R# 10 328.62 70.53 266.12 -9.25 61.87 34.12 .115 .1622选取与其他解差距较大且Packing值较高的解( Packing = 1 solvent% )目前可用的软件很多，各具优势，根据自己的要求进行选择；目前可用的软件很多，各具优势，根据

38、自己的要求进行选择；建议：建议： 1. 首先使用首先使用AMORE，进行快速的判断；进行快速的判断； 2. 若无法得到合适的结果，再选择若无法得到合适的结果，再选择CNS, EPMR, PHASER等进行等进行进一步的计算；进一步的计算； 3. 若仍然无法得到合适的结果，则对模型坐标进行一定的处若仍然无法得到合适的结果，则对模型坐标进行一定的处理。理。没有固定的模式，多尝试不同的软件，能得到结果的才是最好的。没有固定的模式，多尝试不同的软件，能得到结果的才是最好的。MIR/SIR方法的软件包方法的软件包Heavy atom searchHeavy atom position refinementPhasingPhase improvement: Density modification NCS averaging Phase extendSHELXSOLVE/RESOLVECNS/X-plorSnBO