发酵工程（完整版）

1、固体发酵某些微生物生长需水很少，可利用疏松而含有必需营养物的固体培养基进行发酵生产，称为固体发酵。我国传统的酿酒、制酱及天培(大豆发酵食品) 等的生产均为固体发酵。另外，固体发酵还用于蘑菇的生产、奶酪和泡菜的制作以及动植物废料的堆肥等。固体发酵所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业中的副、废产品，如麸皮、事粉、大豆饼粉、高梁和玉米粉等。根据需要对原料进行粉碎、蒸煮等预加工以促进背养物吸收，改普发酵生产条件，有的需加人尿素、硫酸饺及一些无机酸、碱等辅料。固体发酵一般都是开放式的，因而不是纯培养，无菌要求不高。它的一般过程为:将原料预加工后再经蒸煮灭菌，然后制成含一定水分的固体物料，接人预先

2、培养好的菌种，进行发酵。发酵成熟后要适时出料，并进行适当处理，或进行产物的提取。根据培养基的厚薄可分为薄层和厚层发酵，用到的设备有帘子、曲盘和曲箱等。薄层固体发酵是利用木盘或苇帘，在上面铺12cm 厚的物料，接种后在曲室内进行发酵。厚层固体发酵是利用深槽(或池)，在其上部架设竹帘，帘上铺一尺多厚的物料，接种后在深槽下部给以通气进行发酵。固体发酵所需设备简单，操作容易，并可因陋就简、因地制宜地利用一些来源丰富至今仍在某些产品的生产上不同程度地沿用着。但是这种方法的工农业副产品，因此，例如，劳动强度大，不便于机械化操作，微生物品种少、生长慢，产品有有许多缺点，限等。所以目前主要的发酵生产

3、多为液体发酵。 典型产品的发酵生产1、抗生素发酵生产抗生素是生物体在生命活动中产生的一种次级代谢产物。这类有机物质能在低浓度下抑制或杀灭活细胞，这种作用又有很强的选择性。例如，医用的抗生素仅对造成人类疾病的细菌或肿瘤细胞有很强的抑制或杀灭作用，而对人体正常细胞损害很小，这是抗生素能成为医药的原理。目前，人们在生物体内发现的6000 多种抗生素，约60%来自发酵生放线菌。抗生素主要用微生物发酵法生产，少数抗生素也可用化学方法合成。人们还对7固体天然的抗生素进行生化或化学改造，使其具有更优越的性能，这样得到的抗生素叫半合肥等成抗生素。抗生素不仅广泛用于临床医疗，而且也用在农业、畜牧及环保等领域中。

4、青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。它于1928 年被英国人A.Fleming 发现，20 世纪40 年代投人工业生产，它能有效地控制伤口的细菌感染，在第二次世界大麸战期间挽救了数百万战争中受伤者的性命。下面以青霉素为例简单介绍抗生素的发酵生促产过程。（1） 青霉素发酵生产菌株最初由A.Fleming 分离的点青霉只能产生2U/mL的青靠素。目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株Wis Q176(一种产黄青看Penicillium chrysogenum) 经不同改良途径得到。20 世纪70 年代前，育种采用诱变和随机筛选

5、方法，后来由于原生质体融合技术、基因克隆技术等现代育种技术的应用，青霉素工业发酵生产水平已达85 000U/mL以上。青霉素生产菌株一般在真空冷冻干燥状态下保存其分生孢子，也可以用甘油或乳糖溶剂作悬浮剂，在一70C冰箱或液氮中保存孢子悬浮液和营养菌丝体。（2） 青霉素发酵生产培养基1) 碳源。目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液进行流加。2) 氮源。可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮，并补加无机氮源。3) 前体。苯乙酸或苯乙酰胺，由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加人量不能大于0.1%，并采用多次加人方式。4) 无机盐。包括硫、磷、钙

6、、镁、钾等盐类，铁离子对青霉菌有毒害作用，应在发酵液中将铁含量严格控制在30pug/mL 以下。（3） 发酵工艺流程:1) 种子制备种子种子制备阶段以生产丰富的袍子（斜面和米孢子培养）或大量健壮的菌丝体为目的。为达到这一目的，在培养基中加入比较丰富的容易代谢的碳源(如葡萄糖或蔗糖)，氦源(如玉米浆)、缓冲PH的碳酸钙以及生长所必需的无机盐。并保持最适宜生长温度(25-26C)和充分通气、搅拌。在最适生长条件下，到达对数生长期时菌体量的倍增时间为67h。在工业生产中，种子制备的培养条件及原材料质量均应严格控制，以保持种子质量的稳定性。2) 发酵培养影响青霉素发酵产率的因素有环境因素，如

7、PH、温度、溶氧浓度和碳氮组分含量等; 有生理变量因素，包括菌丝浓度、菌丝生长速度和菌丝形态等，对它们都要进行严格控制。发酵过程中PH一般控制在6.46.6，发酵温度前期为2526%C，后期为23C，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。此外，还要求发酵液中溶氧量不低于饱和溶解氧的30%，通气比一般为1:0.8 wm (单位培养液体积在单位时间内通人的空气量)。3) 发酵后处理a）过滤: 采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。b）提炼: 用溶媒萃取法。将发酵滤液酸化至pH 2.0，加1/3 体积的醋酸丁酯(简称BA),混合后以碟片式离心机分离，得一次BA 萃取液。然后以NaHCO3; 在p

8、H 6.87.1条件下将青霉素从BA 中萃取到缓冲液中。再调节PH 至2.0，将青霉素从缓冲液再次转人到BA 中，方法同上，得二次BA 萃取液。C）脱色: 在二次BA 萃取液中加活性炭脱色，过滤。d）结晶: 用丁醇共沸结晶法。将二次BA 萃取液以NaOH 溶液萃取，调PH 至6.46.8,得青霉素钠盐水浓缩液。之后加34 倍体积的丁醇，进行真空蒸馏，将水与丁醇共沸物蒸出，则青霉素钠盐结晶析出，过滤，将晶体洗涤后干燥即得成品。2、氨基酸发酵生产氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是人体及动物的重要营养物质，氨基酸产品广泛应用于食品、饲料、医药、化学和农业等领城。以前，氨基酸主要是由酸水解蛋白质制得，现

9、在氨基酸的生产方法有发解法。提取法、合成法和酶法等，其中最主要的是发酵法，用发酵法生产的氨基酸已有20 多种。在谷氨酸是一种重要的氨基酸。食用味精是以谷氨酸为原料生成的谷氨酸单钠的俗称，谷氨酸还可以制成对皮肤无刺激性的洗涤剂(十二烷基谷氨酸钠肥皂)、能保持皮肤湿润的润肤剂(谷氨酸钠)、质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种，同时，谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型和最成熟的。我们就以谷氨酸为例简单介绍一下氨基酸的发酵生产。（1）谷氨酸发酵生产的菌种谷领酸发酵生产的菌种主要有棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌

10、。除节杆菌外，其他三属中有许多菌种适用于糖质原料的谷氨酸发酵。这些细菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。我国谷氨酸发酵生产所用菌种有北京棒状杆菌、AS1542、HU7251及7338、B9、AS1299，钝齿棒状杆菌等。这些菌株的斜面培养一般采用由蛋白胨、牛肉膏和氯化钠等组成的，pH 为7.07.2的琼脂培养基，32C培养24h,冰箱保存备用。（2）谷氨酸发酵生产的原料制备谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料。淀粉水解糖的制备一般有酸水解法和酶水解法两种。国内常用的是淀粉酸水解工艺，干淀粉加水调成一定浓度的淀粉乳，用盐酸调用N aOH至PH 1.5 左右。然后

11、直接用蒸汽加热，水解约25min,冷却糖化液至80*C，调节PH 至4.05.0，使糖化液中的蛋白质和其他胶体物质沉淀析出。最后用粉末状即得到淀粉水解液。活性炭脱色，在4560“C下过滤，（3）菌种扩大培养 1）一级种子培养。采用液体培养基，由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰等组成，pH 为6.56.8，在三角瓶内32C振荡培养12h,贮干4"C 冰箱备用。2) 二级种子培养。培养基除用水解糖代替葡萄糖外，其他与一级种子培养基相仿。在种子罐内32C通气搅拌培养710h,即可移种或冷却至10“C备用。（4）谷氨酸发酵生产发酵初期，菌体生长迟滞，24h

12、后即进人对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的PH 至7.58.0，同时保持温度为3032%C。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12h。随后转人谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的a-酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成的最适pH 7.27.4，需要大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成的最适温度34糖耗慢，残糖低，需减少流加尿素量。当营养物质耗尽、37C。发酵后期，菌体衰老，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐。发酵周期约为30h。（5）谷氨酸提取谷氨酸提取有等电点法

13、、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述方法结合使用的方法。国内多采用的是等电点一一离子交换法。谷氨酸的等电点为3.22，这时它的溶解度最小，所以将发酵液用盐酸调节到pH 3.22，谷氨酸就可析出结晶。晶核形成的温度一般为2530"C，为促进结晶，需加入a 型晶种育晶2h。等电点搅拌之后静置沉降，再用离心法分离即可得到谷氨酸结晶。等电点法提取了发酵液中的大部分谷氨酸，剩余的谷氨酸可用离子交换法进一步分离提纯和浓缩回收。谷氨酸是两性电解质，故与阳性或阴性树脂均能进行交换。当溶液PH低于3.2时，谷氨酸带正电，能与阳离子树脂进行交换。目前国内多用国产732 型强酸性阳离

14、子交换树脂来提取谷领酸，然后在65左右，用NOH 溶液洗脱，州3.0-7.0的洗脱液返回等电点法提取。3、维生素发酵生产维生素是人体生命活动必需的要素，主要以辅酶或辅基的形式参与生物体各种生化反应。维生素在医疗中具有重要作用。例如，维生素B族用于治疗神经炎、角服炎等多种炎症，维生素D是治疗佝偻病的重要药物等。此外，维生素还应用于畜牧业及饲料工业中。维生素的生产多采用化学合成法，后来人们发现某些微生物可以完成维生素合成中的某些重要步骤。在此基础上，化学合成与生物转化相结合的半合成法在维生素生产中得到了广泛应用。目前，可以用发酵法或半合成法生产的维生素有维生素C、BZ、Brz、D,以及P-胡萝卜素

15、等。维生素C 又称抗坏血酸，能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激人体造血功能，增强机体的免疫力。另外，由于它具有较强的还原能力，可作为抗氧化剂，已在医药、食品工业等方面获得广泛应用。维生素c 的化学合成方法一般指莱氏法，后来人们改用微生物脱氢代替化学合成中L-山梨糖中间产物的生成，使山梨糖的得率提高1倍。我国进一步利用另一种微生物将L山梨糖转化为2-酮基-L古龙酸，再经化学转化生产维生素c,称为两步法发酵工艺。这种方法使得维生素C 的产量得到大幅度提高，简单介绍如下:第一步发酵是生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter mel la nogenus ) 或弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxrydans) 经过二级种子扩大培养，种子液质量达到转种液标准时，将其转移至含有山梨醇、玉米粉、磷酸盐和碳酸钙等组分的发酵培养基中，在