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1、会计学1Westernblot技术详细技术详细第1页/共27页快速、特异，信号弱、昂贵快速、特异，信号弱、昂贵信号强、二抗选择多，非特异性结合信号强、二抗选择多，非特异性结合第2页/共27页l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色n蛋白样品的制备第3页/共27页第4页/共27页第5页/共27页第6页/共27页第7页/共27页第8页/共27页第9页/共27页第10页/共27页第11页/共27页大于大于20KD0.45 um20KD0.2 um7KD0.1 um第12页/共27页转膜第13页/共27页湿转第14页/共27页半干转第15页/共27页第16页/共27页一抗、二抗孵育第17页/共27页
2、辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)DAB 第18页/共27页第19页/共27页第20页/共27页第21页/共27页？ 第22页/共27页背景太高膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染封闭不充分封闭不充分抗体与封闭剂出现抗体与封闭剂出现交叉反应交叉反应抗体浓度过高抗体浓度过高 原原因因对对策策转膜前用转膜前用100%甲醇将甲醇将膜完全浸湿膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓手套，更换新鲜转膜缓冲液冲液检测一抗、二抗与封闭检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗杂交前检测一抗、二抗的工作浓度的工作浓度第23页/共27页没有阳性条带或比较弱抗体染色不充分抗体染色不充分靶蛋白含量太低靶蛋白含量太低HRP抑制剂抑制剂转膜时间不够转膜时间不够曝光时间过短曝光时间过短 原原因因对对策策增加抗体滴度，延长孵增加抗体滴度，延长孵育时间育时间增加样本上样量增加样本上样量所用溶液和容器中避免所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠含有叠氮化钠大分量蛋白相应增加转大分量蛋白相应增加转膜时间及曝光时间膜时间及曝光时间第24页/共27页弥散性条带或非特异性条带抗体浓度太高抗体浓度太高蛋白上样量太多蛋白上样量太多交叉反应交叉反应 原原因因对对策
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