细胞与组织培养技术

1、细胞与组织培养技术细胞与组织培养技术 动物细胞部分动物细胞部分实验安排实验安排：第九周 实验一 动物细胞培养实验的器材准备 实验二 培养用液的配制及过滤除菌 第十周 实验三 培养细胞的形态观察 实验四 动物细胞的传代培养 实验五 培养细胞的超低温冻存第十一周 实验六 冻存细胞的复苏 实验七 培养细胞的细胞计数与活性测定第十二周 实验八 动物细胞的原代培养（大鼠骨髓间充质干细胞的培养）细胞培养细胞培养 是在体外模拟体内生理环境（温度、pH值、营养条件等）使从体内取出的细胞生存、生长繁殖的技术方法。原代培养原代培养 又叫初代培养，是指从动物或人体内取出细胞，经过一定的处理和分离，置于适当的器皿或培

2、养基等条件下，培养至第1次传代之前的细胞培养阶段。P17传代培养传代培养 是指原代培养细胞在适应体外条件下后持续生长增殖，达到一定细胞密度后，需要将细胞从一个培养器皿以一定的比例转移到另一个装有新鲜培养基的器皿中的这样一个过程称为传代培养。细胞培养的优点及不足之处原代细胞培养的生命归宿 1.原代培养期原代培养期：有细胞分裂，不旺盛；原代培养细胞与体内原组织在形态结构和动能活动上相似性大；细胞群呈异质性 2. .传代期传代期：持续时间最长，细胞增殖旺盛 3.3.衰退期衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖；细胞轮廓增强，最后衰退死亡培养细胞的生长方式 1.贴壁依赖型贴壁依赖型：必须贴附于支持物表面才能生长

3、，大多数培养细胞都属于贴附生长型。 2.悬浮生长型悬浮生长型：见于少数造血系统肿瘤细胞，胞体呈圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长，这类细胞容易大量繁殖。培养过程中需定期摇匀，使细胞与培养基充分接触。每代贴壁细胞的生长过程1.游离期游离期 细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，胞体呈圆形，持续时间约为10分钟-4小时2.贴壁期贴壁期 细胞附着于培养介质上，游离期结束，细胞株一般在10分钟-4小时贴壁，初代培养细胞贴壁慢，可长达24小时或者更多。3.潜伏期潜伏期 此期细胞有生长活动，少有细胞分裂，基本无增殖。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质有关。细胞株潜伏期一般为6-24小时。4.对数生长期

4、对数生长期 细胞增殖最旺盛时刻，细胞数随时间变化成倍增长，细胞活力最佳，是进行各种实验的最佳时期。5.停滞期停滞期 细胞数量达饱和状态，细胞虽有活力但不再分裂，细胞数量不再增加，应尽早传代。发生机制：接触抑制，密度依赖。培养细胞的生长条件1.营养需要：基础培养基、血清、促生长及促粘附因子2.生存条件：温度 370.5 气体条件 5%CO2 pH值条件 7.2-7.4 渗透压：等渗3.无污染4.无毒 实验一 动物细胞培养实验的器材准备实验目的：实验目的：1.了解动物细胞培养的洁净要求，建立无菌操作的概念。2.掌握细胞培养实验的材料准备过程。3.掌握动物细胞培养用液的配制和酸碱度调节方法。实验原理

5、实验原理：准备内容：1.实验用品的洗涤、包装和灭菌 2.准备酒精棉球，整理超净台 3.配制PBS KH2PO4 0.24g Nacl 8.0g KCl 0.2g NaHPO4 1.44g 加适量纯水溶解，调节pH值至7.4，定容至1000ml实验二 动物培养用液的配制及过滤除菌培养用液包括：培养基（需要添加血清） 消化液 平衡盐溶液一、培养基 现在多采用合成培养基，其成分包括氨基酸、葡萄糖、维生素、无机盐及一些促生长因子、促贴壁因子等。常用的有RPMI1640、DMEM等。二、血清 多使用胎牛血清或优质小牛血清三、消化液 常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA以及胶原酶溶液，以胰蛋白酶使用最多。酶液

6、用于解离细胞间的蛋白质、胶原等，使细胞离散。EDTA是二价螯合剂，能结合钙离子、镁离子，使以来钙离子的的钙粘着蛋白失活而使细胞解离。四、平衡盐溶液 如PBS、Hanks液等酚红对pH值的指示： pH值6.5 黄色 pH值7.0 橘红色 pH值7.4 红色 pH值7.8 紫红色细胞生长的最适pH值范围：7.2-7.4实验内容：1.滤器的安装和消毒2.0.25%胰酶：0.25g胰蛋白酶溶于适量PBS中，调节pH值至7.6，定容至100ml，过滤除菌。3.1640基础培养基的配制：1包（10.4g）溶于适量纯水中，调节pH值至7.2-7.4，完全溶解后定容至1000ml，过滤除菌。4.1640完全培

7、养基的配制: 1640基础培养基 85ml 血清 15ml 双抗(青霉素和链霉素) 0.5ml实验三 动物细胞的原代培养一（胰酶消化法） 实验目的实验目的1、了解动物细胞原代培养的基本方法和操作过程。2、了解原代培养细胞观察的方法。实验原理实验原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养可分为组织块培养法和消化法。 实验步骤：实验步骤：1.将大鼠颈椎脱臼处死，置医用酒精中泡23分钟，取大鼠带入超净台内，置平皿中，解剖取肝脏，置于一新的平皿中。2

8、.用 Hanks液 洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织血液等杂物。3.用一新的手术剪将肝脏剪成小块，再用Hanks液 洗三次，转移至50ml离心管中。4.视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37消化20-40分钟，每隔5分钟震荡一次。5.加入3-5ml培养基以终止胰酶消化作用。6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到10ml离心管中。7.1000rpm离心10分钟，弃上清液。8.加入Hanks液 5ml，重悬细胞，再离心一次，弃上清液。9.加入适量培养基，重悬细胞，转移至培养皿中培养。注意事项注意事项 1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 2、在超净台中，组织细胞、

9、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 无菌操作的几个注意事项无菌操作的几个注意事项 1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45斜位。 6、吸溶液的吸

10、管等不能混用。 实验四 动物细胞的原代培养二（大鼠骨髓间充质干细胞的培养） 骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓内的一种多能干结缔组织前体细胞，具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下能分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞等。在胚胎发育过程中，软骨、骨、肌肉、肌腱、脂肪、神经和髓基质等多种间充质组织由中胚层细胞分化而来，这些前体细胞具有干细胞特性而被定义为间充质干细胞(Mesenchymai stem ceiis，MSC)。骨髓间充质干细胞是骨髓中的非造血干细胞。 实验步骤：实验步骤：1.将大鼠颈椎脱臼处死，置医

11、用酒精中泡23分钟，取大鼠带入超净台内，置平皿中，无菌条件下完整取出双侧股骨 。2.在另一平皿中倒入适量PBS，将股骨浸泡于PBS中，无菌条件下剔除肌肉和脂肪组织。 3.暴露股骨骨骺端，经PBS冲洗干净后剪去两端干骺端，暴露骨髓腔。4.用注射器吸取2ml 1640完全培养液冲洗骨髓腔，冲洗液收集在小烧杯中收集细胞，反复冲洗，直至冲出的液体发白为止。5.加入适量新鲜培养液，用吸管轻轻吹打制成细胞悬液，接种于培养皿内，置5% CO、37饱和湿度培养箱内培养。 实验六 动物细胞的传代培养实验目的实验目的掌握贴壁细胞传代的方法。实验原理实验原理 细胞在培养瓶增殖到一定密度后，细胞的生长和分裂的速度就会

12、减慢甚至停止，如不及时分离、传代，细胞将逐渐衰老死亡。为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 实验步骤：实验步骤： 1、在超净台内的酒精灯旁，将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入37预温的PBS，轻轻振荡漂洗1-2次。 2、加入适量 0.25胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。盖上瓶盖，在37消化2-3min。 3、倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml培养液终止消

13、化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为13分钟。 4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另1瓶中，盖上瓶盖，在培养瓶上做好标记，（细胞种类、日期等）置37下继续培养。 实验七 培养细胞的超低温冻存与复苏实验目的实验目的掌握细胞冻存和复苏的方法。实验原理实验原理细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞在培养过程中，为防止细胞株不断传代引起的细胞老化、支原体污染、染色体和基因的变异等现象的发生，可以通过冻存技术保存细胞。在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变

14、、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，减少冰晶的形成。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。实验步骤：实验步骤：（一）细胞冻存1、超净台中消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养基。4、将悬液分至冻存管中，每管0.8 ml。旋紧冻存管管盖。5、在冻存管上标明细胞种类，冻存日期。6、按下列顺序降温：室温4（20分钟冰箱冷

15、冻室（30分钟）低温冰箱（30 1小时）气态氮（30分钟）液氮。（二）细胞复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、在超净台中用75%乙醇擦拭冻存管外壁并打开，用吸管将细胞悬液吸到离心管中。4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。5、沉淀加入适量培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37培养。实验八 培养细胞的细胞计数与活性测定实验目的实验目的1、掌握细胞计数的方法2、掌握细胞细胞活力测定的方法实验原理实验原理培养的细胞在一般条件下

16、要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。细胞活性测定方法：1.染料排斥法：如台盼兰法，活细胞不着色，死细胞着色。2.FDA-PI双色荧光镜检法：活细胞呈现黄绿色荧光，荧光越强，细胞活性越高；死细胞呈橘红色荧光。3.MTT法：活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使四甲基偶氮唑盐（MTT）分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 4.Cell blue法：活细胞可将氧化还原染料刃天青转化为红色