利用Spurr树脂包埋制备植物半薄切片方法研究

1、    利用spurr树脂包埋制备植物半薄切片方法研究    王伟+朱佩燕摘 要：以拟南芥的根和叶片为材料，对利用spurr树脂低粘度包埋剂进行植物样品包埋技术进行了讨论和改进。关键词：半薄切片；spurr树脂；技术q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技术是将以树脂作为包埋剂，用超薄切片机或石蜡切片机进行切片的技术。通过该技术所得到的切片厚度一般为0.53m，介于超薄切片和石蜡切片之间，因而被称为半薄切片，通常用于光学显微镜进行较细微组织的观察，或用于电子显微镜的初步组织定位1-2。半薄切片的制备与电镜超薄切片的步骤较为类似

2、，也需要经过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，但由于其组织结构保存较好，而且切片较薄，因此在光镜下对于较细微组织结构的观察效果要比常规石蜡切片好，目前已被广泛应用于植物各个组织的显微结构的观察。传统上常采用epon 812作为包埋剂来制备半薄切片，但由于植物细胞具有细胞壁，尤其对于根尖及种子等材料，其具有致密的细胞结构，而epon 812树脂的粘度较高，因而在使用epon 812树脂作为包埋剂时，有时会出现渗透不好的问题，切片过程中出现空洞或破碎等现象；且由于epon 812树脂易吸潮，在湿度大的时候容易发软，使得难以切出较好的样品3。而低黏度包埋剂spurr树脂相对于epon 812树脂，

3、具有黏度低、渗透效果好、所需聚合时间短等优点，更适用于植物材料的包埋处理。本文利用spurr树脂作为包埋剂制备了拟南芥的叶及根的半薄切片，并对利用spurr树脂包埋制备植物半薄切片的方法及可能遇到的一些问题进行了探讨。1 材料与方法1.1 供试材料 拟南芥成熟叶片及根。spurr树脂包埋试剂盒购自美国polyscience公司，由erl4221树脂、d.e.r736增塑剂、nsa硬化剂和dmae催化剂4种成分组成。1.2 实验方法 取新鲜叶片或根用双面刀片切成35mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸钠缓冲液（ph7.2）中，抽气后置于4

4、固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，然后将样品转移至含有2%锇酸的二甲基砷酸钠缓冲液中放置2h进行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，经25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐级脱水，每级不少于30min。无水乙醇脱水2h以上，并经环氧丙烷进一步置换脱水2次，每次1020min，将预先混合配制好的spurr树脂和环氧丙烷按11渗透1h以上，再次用spurr树脂渗透样品2h。利用小的pcr管或ep管为模具，将样品置于树脂中进行包埋，70聚合24h以上，冷却后即可进行半薄切片。切片厚度通常为12m，用

5、睫毛笔捞片至载玻片上，加水放展片台上60进行展片，并滴加0.5%结晶紫溶液进行染色。2 结果与分析3 讨论（1）spurr树脂生产商厂家给出的标准配方。但由于spurr树脂受温度和湿度影响较大，因此，在实际应用时，应当根据气候和工作条件的不同来调整配方。一般在北方的冬季需适当增加增塑剂的含量，而在夏季和南方等雨水较多地区则应适当增加硬化剂的含量。由于包埋试剂盒中的硬化剂nsa对水分敏感，因此混合好的树脂应存放于密闭的干燥器中，尽量减少暴露于空气中的时间，并尽快与材料共同转入pcr或ep管中盖紧盖子进行聚合。由于spurr树脂中的成分可与硅胶反应，应尽量避免使用硅胶模具，防止两者之间粘连导致包埋

6、块难以取出或变脆。（2）在包埋样品时，应根据所需进行切片的方向对材料位置进行调整。对于拟南芥根或叶片较为细薄的样品，可在样品下沿与样品轴向垂直方向放置一根或若干根干净的头发丝，避免样品过于接近包埋块的边缘，从而有利于修块并防止由于过于接近包埋块边缘而在切片时出现碎裂现象。（3）在进行染色的过程中，则需要保持在60加热条件下滴加结晶紫溶液进行染色，染色液配置后需过滤去除杂质后才可使用，染色23min后用水蒸馏水洗去多余染液，滤纸吸干，于60继续展片干燥后即可观察或中性树胶封片。参考文献1李和平.植物显微技术m.北京：科学出版社，2009：67-78.2于红丽，张大红，徐夏红，等.电镜半薄切片制备

7、方法的改进j.徐州医学院学报，2004，24（2）：129-130.3杨瑞，范敬伟，刘文可，等.植物透射电镜样品制备技术的改进及不同树脂选择比较j.北京农学院学报，2013，28（4）：5-7.（责编：张宏民）endprint摘 要：以拟南芥的根和叶片为材料，对利用spurr树脂低粘度包埋剂进行植物样品包埋技术进行了讨论和改进。关键词：半薄切片；spurr树脂；技术q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技术是将以树脂作为包埋剂，用超薄切片机或石蜡切片机进行切片的技术。通过该技术所得到的切片厚度一般为0.53m，介于超薄切片和石蜡切片之间，因而被称为半薄切片，通常用于

8、光学显微镜进行较细微组织的观察，或用于电子显微镜的初步组织定位1-2。半薄切片的制备与电镜超薄切片的步骤较为类似，也需要经过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，但由于其组织结构保存较好，而且切片较薄，因此在光镜下对于较细微组织结构的观察效果要比常规石蜡切片好，目前已被广泛应用于植物各个组织的显微结构的观察。传统上常采用epon 812作为包埋剂来制备半薄切片，但由于植物细胞具有细胞壁，尤其对于根尖及种子等材料，其具有致密的细胞结构，而epon 812树脂的粘度较高，因而在使用epon 812树脂作为包埋剂时，有时会出现渗透不好的问题，切片过程中出现空洞或破碎等现象；且由于epon 812树脂易

9、吸潮，在湿度大的时候容易发软，使得难以切出较好的样品3。而低黏度包埋剂spurr树脂相对于epon 812树脂，具有黏度低、渗透效果好、所需聚合时间短等优点，更适用于植物材料的包埋处理。本文利用spurr树脂作为包埋剂制备了拟南芥的叶及根的半薄切片，并对利用spurr树脂包埋制备植物半薄切片的方法及可能遇到的一些问题进行了探讨。1 材料与方法1.1 供试材料 拟南芥成熟叶片及根。spurr树脂包埋试剂盒购自美国polyscience公司，由erl4221树脂、d.e.r736增塑剂、nsa硬化剂和dmae催化剂4种成分组成。1.2 实验方法 取新鲜叶片或根用双面刀片切成35mm厚的薄片或小段，

10、放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸钠缓冲液（ph7.2）中，抽气后置于4固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，然后将样品转移至含有2%锇酸的二甲基砷酸钠缓冲液中放置2h进行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，经25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐级脱水，每级不少于30min。无水乙醇脱水2h以上，并经环氧丙烷进一步置换脱水2次，每次1020min，将预先混合配制好的spurr树脂和环氧丙烷按11渗透1h以上，再次用spurr树脂渗透样品2h。利用小的pcr

11、管或ep管为模具，将样品置于树脂中进行包埋，70聚合24h以上，冷却后即可进行半薄切片。切片厚度通常为12m，用睫毛笔捞片至载玻片上，加水放展片台上60进行展片，并滴加0.5%结晶紫溶液进行染色。2 结果与分析3 讨论（1）spurr树脂生产商厂家给出的标准配方。但由于spurr树脂受温度和湿度影响较大，因此，在实际应用时，应当根据气候和工作条件的不同来调整配方。一般在北方的冬季需适当增加增塑剂的含量，而在夏季和南方等雨水较多地区则应适当增加硬化剂的含量。由于包埋试剂盒中的硬化剂nsa对水分敏感，因此混合好的树脂应存放于密闭的干燥器中，尽量减少暴露于空气中的时间，并尽快与材料共同转入pcr或e

12、p管中盖紧盖子进行聚合。由于spurr树脂中的成分可与硅胶反应，应尽量避免使用硅胶模具，防止两者之间粘连导致包埋块难以取出或变脆。（2）在包埋样品时，应根据所需进行切片的方向对材料位置进行调整。对于拟南芥根或叶片较为细薄的样品，可在样品下沿与样品轴向垂直方向放置一根或若干根干净的头发丝，避免样品过于接近包埋块的边缘，从而有利于修块并防止由于过于接近包埋块边缘而在切片时出现碎裂现象。（3）在进行染色的过程中，则需要保持在60加热条件下滴加结晶紫溶液进行染色，染色液配置后需过滤去除杂质后才可使用，染色23min后用水蒸馏水洗去多余染液，滤纸吸干，于60继续展片干燥后即可观察或中性树胶封片。参考文献

13、1李和平.植物显微技术m.北京：科学出版社，2009：67-78.2于红丽，张大红，徐夏红，等.电镜半薄切片制备方法的改进j.徐州医学院学报，2004，24（2）：129-130.3杨瑞，范敬伟，刘文可，等.植物透射电镜样品制备技术的改进及不同树脂选择比较j.北京农学院学报，2013，28（4）：5-7.（责编：张宏民）endprint摘 要：以拟南芥的根和叶片为材料，对利用spurr树脂低粘度包埋剂进行植物样品包埋技术进行了讨论和改进。关键词：半薄切片；spurr树脂；技术q81 a 1007-7731（2014）16-16-02半薄切片技术是将以树脂作为包埋剂，用超薄切片机或石蜡切片机进行

14、切片的技术。通过该技术所得到的切片厚度一般为0.53m，介于超薄切片和石蜡切片之间，因而被称为半薄切片，通常用于光学显微镜进行较细微组织的观察，或用于电子显微镜的初步组织定位1-2。半薄切片的制备与电镜超薄切片的步骤较为类似，也需要经过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，但由于其组织结构保存较好，而且切片较薄，因此在光镜下对于较细微组织结构的观察效果要比常规石蜡切片好，目前已被广泛应用于植物各个组织的显微结构的观察。传统上常采用epon 812作为包埋剂来制备半薄切片，但由于植物细胞具有细胞壁，尤其对于根尖及种子等材料，其具有致密的细胞结构，而epon 812树脂的粘度较高，因而在使用epon

15、 812树脂作为包埋剂时，有时会出现渗透不好的问题，切片过程中出现空洞或破碎等现象；且由于epon 812树脂易吸潮，在湿度大的时候容易发软，使得难以切出较好的样品3。而低黏度包埋剂spurr树脂相对于epon 812树脂，具有黏度低、渗透效果好、所需聚合时间短等优点，更适用于植物材料的包埋处理。本文利用spurr树脂作为包埋剂制备了拟南芥的叶及根的半薄切片，并对利用spurr树脂包埋制备植物半薄切片的方法及可能遇到的一些问题进行了探讨。1 材料与方法1.1 供试材料 拟南芥成熟叶片及根。spurr树脂包埋试剂盒购自美国polyscience公司，由erl4221树脂、d.e.r736增塑剂、

16、nsa硬化剂和dmae催化剂4种成分组成。1.2 实验方法 取新鲜叶片或根用双面刀片切成35mm厚的薄片或小段，放入含有4%（w/v）多聚甲醛、2%（w/v）戊二醛的50mm的二甲基砷酸钠缓冲液（ph7.2）中，抽气后置于4固定24h以上。然后用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，然后将样品转移至含有2%锇酸的二甲基砷酸钠缓冲液中放置2h进行前染色，再次用50mm的二甲基砷酸钠缓冲液分4次，每次浸泡15min进行清洗，经25%，50%，75%，95%和100%乙醇逐级脱水，每级不少于30min。无水乙醇脱水2h以上，并经环氧丙烷进一步置换脱水2次，每次1020min

17、，将预先混合配制好的spurr树脂和环氧丙烷按11渗透1h以上，再次用spurr树脂渗透样品2h。利用小的pcr管或ep管为模具，将样品置于树脂中进行包埋，70聚合24h以上，冷却后即可进行半薄切片。切片厚度通常为12m，用睫毛笔捞片至载玻片上，加水放展片台上60进行展片，并滴加0.5%结晶紫溶液进行染色。2 结果与分析3 讨论（1）spurr树脂生产商厂家给出的标准配方。但由于spurr树脂受温度和湿度影响较大，因此，在实际应用时，应当根据气候和工作条件的不同来调整配方。一般在北方的冬季需适当增加增塑剂的含量，而在夏季和南方等雨水较多地区则应适当增加硬化剂的含量。由于包埋试剂盒中的硬化剂nsa对水分敏感，因此混合好的树脂应存放于密闭的干燥器中，尽量减少暴露于空气中的时间，并尽快与材料共同转入pcr或ep管中盖紧盖子进行聚合。由于spurr树脂中的成分可与硅胶反应，应尽量避免使用硅胶模具，防止两者之间粘连导致包埋块难以取出或变脆。（2）在包埋样品时，应根据所需进行切片的方向对材料位置进行调整。对于拟南芥根或叶片较为细薄的样品，可在样品下沿与样品轴向垂直方向放置一根或若干根干净的头发丝，避免样品过于接近包埋块的边缘，从而有利于修块并防止由于过于接近包埋块边缘而在切片时出现碎裂现象。（3）在进行染色