病毒的分离鉴定

1、病毒的别离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，那么必须满足以下原那么： 从患病者体内别离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性； 在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；能重新别离出病毒。1. 病毒的别离1.1标本的处理标本的收集a) 粪便标本：将 5g 粪便标本和 50mlPBS 放入盛有 20-25 颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g, 4C离 心 6min 。b) 拭子和生物体液：拭子浸在 2-3ml 运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应 3000X g4C离心 30min。c) 组

2、织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时参加足量的PBS制备成20%的悬液，3000Xg4C离心30min。除菌处理a) 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。b) 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时c对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、 肠道病毒、呼肠孤病毒、 腺病毒、 痘病毒等，那么可参加等量的乙醚 4 C过夜除菌。1.2病毒的别离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物， 培养病毒必须使用细胞。 根据 病毒的不同选用敏感动物动物接种 、鸡胚鸡胚接种或离体细 胞进行别离培养细胞培养 。鸡胚接种a鸡卵的选择：一般都选新鲜、 10 天以内的受精卵以保

3、证规格质量 上的一致。b孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行 ,气室向上，孵育的最适温 度为38-39 C相对湿度为40 70 %，孵育8日后，鸡卵应每天 翻动 12次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。c检卵：鸡卵孵育45天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况二 天一次。未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。活鸡 卵：鸡胚发育 4 天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内 有一小黑点鸡胚，有明显的自然转动。死胎：如果发现鸡卵 血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，那么可判断胚 胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔 划出气室边缘和胚胎的位置待用。d接种：图1.鸡胚卵

4、黄囊接种： 用58天鸡胚，以细 长针头由鸡卵气室端用1214天鸡胚，将 12天鸡胚，将标本接种 检材注入羊膜腔，孵育 于尿囊腔，孵育后取尿e剖检及收获收获前鸡胚应置4 C冰箱过夜，使 鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气 室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去不 要将碎片落入壳膜。然后用无菌手术 刀柄从胚胎背部轻轻下压，切勿压破卵黄囊再用吸管吸取尿囊 液，置青霉素小瓶内，于低温保存。f优缺点优点：技术简单、来源充分、价格低廉、数量可大、不需特殊 设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。图4.绒毛尿囊膜接种：用1012天鸡胚，以无 菌手续在蛋壳上开一细胞培养细胞培养(cellculture)是

5、指利用机械、酶或化学方法使动物组织 或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。根据细胞 的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培养； 传代细胞培养。组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养 液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻 融、超声波等方法使其释放出来。优点：a) 每个细胞生理特性根本一致，对病毒易感性相等；b) 无个体差异，准确性和重复性好；c) 可严格执行无菌操作；d) 细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；e) 应用空斑技术可进行病毒的克隆化。2. 病毒的鉴定2.1形态学鉴定细胞病变效应(cytopathiceffect, CPE

6、)：病毒在细胞内增殖 后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚 合、溶解或脱落。CPE出现的时间是鉴定病毒的标志之一。某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化,在普通光学显微 镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不 等的圆形或不规那么形的团块状结构,病毒学上称为包涵体。 2.2血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。血吸附指感染细胞具有吸附红 细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培养液中有许多游离病毒存 在，具有凝集红细胞的作用。2.2.1 血吸附实验 具有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这种现象被称作 吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤

7、如下：a用PBS配制10%的豚鼠红细胞悬液，4C保存，用前按需要量稀 释成的浓度10%悬液1ml加19mlPBS混匀。b吸去对照和试验管培养细胞的上清液，试验管的上清液留待电镜 观察。c每管参加红细胞悬液，4C孵育30min。用4C的PBS清洗培养 细胞 3 次。d显微镜下读取结果并记录，根据吸附红细胞的量可分为 0阴 性 4完全吸附级。e37C孵育60min，有神经氨酸酶的病毒将会从红细胞上游离下 来。2.2.2 血凝实验a在血凝板第一排的112孔参加50卩I生理盐水。b在第1孔中参加50卩I病毒，混匀后吸50卩I到第2孔，如此倍 比稀释直到第10孔，混匀后弃50卩I;最后两孔11、12为红

8、 细胞对照。c将1%的红细胞轻轻摇动混匀，在112孔中每孔参加50卩I。d手工震荡，37C静置30min 室温40min后观察结果。2.3电子显微镜检查病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进 行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感 染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电 子显微镜检查，直接观察病毒粒子。2.3.1 正染法：超薄切片法取材-固定戊二醛/四氧化锇-清洗与脱水-浸透、包埋与聚合-切片-染色铀染/铅染a优点：可观察病毒形态和形态发生过程。b缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存。2.3.2 负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周

9、的堆积而加强样品外周的电 子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。具体步 骤漂浮法为：现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上，再 将有支持膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干样品 余液使样品在载网上仅有一薄层液膜，在样品未干时即加一滴复染 液的铜网上，用滤纸吸干多余的染液即可。a优点：快速简易10-20min;分辨率高；图象清晰地病毒结构。b缺点：敏感性低，要求病毒量在 1 07以上；所有样品应处于悬浮状态2.4血清学试验可采用 ELISA 、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血 清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。2.4.1 中和反响 利用病毒与特异性中和抗体结合的特性鉴定病毒的种类，观察 特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病 变效应。2.4.2 酶联免疫吸附