分析化学精品课程课件 第 07 章 吸光光度法

1、 第七章 吸光光度法7.1 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理7.2 光度计及其基本部件光度计及其基本部件7.3 显色反应与条件的选择显色反应与条件的选择7.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择7.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用7.6 紫外吸收光谱法简介紫外吸收光谱法简介spectrophotometry本章要求本章要求: :(1)熟悉吸光光度法的基本原理、特点及应用；(2)掌握朗伯-比尔定律及偏离朗伯-比尔定律的原因；(3)掌握影响显色反应的因素和显色条件的选择、吸光度测量条件的选择；(4)掌握单组分分析、多组分分析、双波长分光光度法、示差法的原理及特点；(5)熟悉影响吸收光

2、谱的因素；(6)了解有机化合物电子跃迁的类型,紫外吸收光谱法的应用;(7)了解光度计及其基本部件。九寨沟的水为啥出名？不同的颜色？九寨沟的水为啥出名？不同的颜色？吸光光度法概述吸光光度法概述 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法为吸光光度法。包括：比色法、可见分光光度法、紫外分光光度法。特点：特点：(1) 灵敏度较高，浓度下限达10-510-6 molL-1。(2) 相对误差约为2%5%。(3) 测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛，几乎所有的无机物质和许多有机物质的微量成分都能用此法进行测定。概念： 光是一种电磁波，根据波长或频率排列。光是一种电磁波，根据波长或频率排列。波长范围

3、10-1nm 10-1 10nm 10400nm 400750nm 0.751000m 0.1100cm 11000cm光谱区域 射线 X射线 紫外光 可见光 红外光 微波 无线电 单色光：单色光：复合光：复合光：互补色光：互补色光：具有同一波长的光称为单色光。由不同波长组成的光称为复合光。按一定比例混合可得到白光的两种单色光互称为互补色光。7.1 吸光光度法基本原理光的互补示意图： 光的互补光的互补：蓝：蓝 黄黄表1 物质颜色与吸收光颜色的互补关系吸收光物质颜色颜色波长/nm黄绿紫400450黄蓝450480橙绿 蓝480490红蓝 绿490500紫 红绿500560紫黄绿560580蓝黄5

4、80600绿 蓝橙600650蓝 绿红650780q 有色物质溶液显色：有色物质选择性地吸收了选择性地吸收了不同波长的光。q 物质的颜色是由其主要吸收色光的互补色光决互补色光决定定的。通过比较有色溶液颜色的深浅，可测定有色物质的含量。q 吸光光度法吸光光度法：基于物质对光的：基于物质对光的选择性吸收选择性吸收而建而建立起来的一种分析方法。立起来的一种分析方法。7.1.1 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收M + 热M + 荧光或磷光M + h M *基态基态 激发态激发态E1 （E） E2 E = E2 - E1 = h 量子化量子化 选择性吸收选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不分子

5、结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；同波长光的吸收程度不同；电子能级间跃迁电子能级电子能级间跃迁的同间跃迁的同时总伴随有振动和转时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。动能级间的跃迁。电子光谱中总包含有电子光谱中总包含有振动能级和转动能级振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。线而呈现宽谱带。吸收曲线与最大吸收波长不同波长的单色光照射不同波长的单色光照射 吸收曲线吸收曲线, 最大吸收波长最大吸收波长 max由吸收曲线：（1）吸光度最大处对应于最大吸收波长max；（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，max不变。（3）吸收曲线可作为物质定性分析的依据之一

6、。（4）在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。7.1.2 光的吸收基本定律 朗伯-比耳（Larnbert-Beer）定律1.1.朗伯朗伯比耳定律比耳定律 当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。吸光度与液层厚度吸光度与液层厚度 Ab吸光度与物质浓度吸光度与物质浓度 A c A c bcbIIA0lg式中式中 A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度；吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度液层厚度(光程长度光程长度)，通常以，通常以cm为单位；为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位溶液的

7、摩尔浓度，单位 molL-； ：摩尔吸收系数摩尔吸收系数，单位，单位 Lmol-cm-；或或: A = lg(I0/It) = a b c c：溶液的浓度，单位溶液的浓度，单位gL- a：吸收系数吸收系数，单位，单位Lg-cm- a与与的关系为：的关系为： a = /M （M为摩尔质量）为摩尔质量） 朗伯比耳定律数学表达式（1）在数值上等于浓度为1 mol L-1、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。（2）是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数;（3）在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（4）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的;（5）可作为定

8、性鉴定的参数；摩尔吸收系数摩尔吸收系数 （6） 是物质的吸光能力的量度:max越大，该物质的吸光能力越强，光度法测定该物质的灵敏度越高。 105 ：超高灵敏； = (610）104 ：高灵敏； = 104 103 ：中等灵敏； 103 ：不灵敏。摩尔吸收系数摩尔吸收系数 cbIITA0lglg 透光度（透光率）透光度（透光率）T : 描述入描述入射光透过溶液的程度。射光透过溶液的程度。 T = I / I0吸光度吸光度A与透光度比与透光度比T 的关系的关系:(1) 吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。(2) 吸光度具有加和性。nnnbcbcbcAAA221121A总7.1.3 偏离比耳定律的

9、原因1. 1. 现象现象 用用标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。2. 2. 引起偏离的因素引起偏离的因素（两大类）（两大类） （1 1）物理性因素，物理性因素， 即仪器的非理想引起的； （2 2）化学性因素。化学性因素。物理性因素： 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带-非单色光！复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。另外，非平行入射光、介质的不均匀性引起光的散射会引起对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 非单色光作为入射光引起的偏离：假设由波长为1和2的两单色光组成的入射光通过浓度为c

10、的溶液，则： A1lg（01 /t1 ） 1 bc A2lg(02 /t2 ） 2 bc故：故：式中：01、02分别为1、2 的入射光强度； t1 、t2分别为1、2 的透射光强度； 1、 2分别为1、2的摩尔吸收系数；cbcbIIII21211110;100t0t A总总 = lg（0总总/t总总 ) = lg(I01 +02)/(t1 +t2 ） = lg(I01 +o2)/(01 10 - 1bc +02 10 - 2bc ）因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A总总，故，故讨论：讨论： (1) 1= 2 则：则： A总 lg（o /t） bc(2) 1 2 A与C不成直线， 1

11、 、 2相差越大，偏离直线越严重。讨论：讨论： (3) 1 2： 可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。随着c值增大， A-c曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯-比耳定律只适用于稀溶液。 (4) 为克服非单色光引起的偏离，应选择比较好的单色器,将入射波长选定在max且吸收曲线较平坦处。 选用谱带a的复合光进行测量，得到右图的工作曲线，A与c基本呈直线关系。 选用谱带b的复合光进行测量， 工作曲线明显偏离线性。(2) 化学性因素朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；仅在稀溶液(c 10-2 mol L-1时，每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布，其相互作用可使它们的

12、吸光能力发生改变。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，使吸光质点的浓度发生变化。 例： 2CrO42- + 2H+ = Cr2O72- + H2O7.2 光度计及其基本部件1.1.分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计7.2.1 基本组成光源单色器样品室检测器显示722型分光光度计型分光光度计7.2.2 主要部件1. 1. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫

13、外区紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。2. 2. 单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。 单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。 色散元件：棱镜或光栅，使不同波长的光以不同角度传播。 构成：狭缝、准直镜、棱镜或光栅、会聚透镜。构成：狭缝、准直镜、棱镜或光栅、会聚透镜。 入射入射狭缝狭缝准直准直镜镜物镜物镜棱镜棱镜焦面焦面出射出射狭缝狭缝f入射狭缝入射狭缝准直镜准直镜光栅光栅物镜物镜出射狭缝出射狭缝f其中最主要的分光元件为棱镜和

14、光栅其中最主要的分光元件为棱镜和光栅3. 3. 样品室样品室吸收池: 比色皿，玻璃（可见） 石英（可见、紫外） 为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。 将光信号转化成电信号-光电管，光电倍增管，光伏电池。 5. 5. 读出系统读出系统 百分透光率T%，吸光度A 4. 4. 检测系统检测系统1个个光电子可产生光电子可产生106107个电子个电子光电倍增管光电倍增管7.2.3 分光光度计的类型分光光度计的类型多通道仪器多通道仪器（Multichannel Instruments） 光电二极管阵列光电二极管阵列(通常具有通常具有316个硅二极管个硅二极管) photodiode ar

15、rays (PDAs) 同时测量同时测量200820nm范围内的整个光谱范围内的整个光谱, 比单比单个检测器快个检测器快316倍倍,信噪比增加信噪比增加 316 1/2 倍倍. 其他类型分光光度计其他类型分光光度计将光度计放入样品中将光度计放入样品中, , 原位测量原位测量纤维光度计纤维光度计7.3 显色反应与条件的选择 将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。与待将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。7.3.1 7.3.1 显色反应的选择显色反应的选择1.1.选择显色反应时，应考虑的因素选择显色反应时，

16、应考虑的因素 (1)(1)灵敏度高(2)选择性好(3)生成物组成恒定、化学性质稳定（4）显色剂在测定波长处无明显吸收（5）显色条件易于控制。2.2.配位显色反应配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。3.氧化还原显色反应 某些元素的氧化态，如Mn（）、Cr（）在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。 例如：钢中微量锰的测定， 2 Mn2 5 S2O82-8 H2O =2 MnO4- + 10 SO42- 16H+ 将Mn2 氧化成紫红色的MnO4-后，在525 nm处进行测定。7.3.2 显色剂无机显

17、色剂：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。有机显色剂：有机显色剂：种类繁多偶氮类显色剂：偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。三苯甲烷类：三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等7.3.3 显色反应条件的选择1.1.显色剂显色剂用量用量 吸光度A与显色剂浓度cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2.2.酸度酸度3.3.显色时间显色时间 4.4.显色温度显色温度5.溶剂溶剂影响配合物的离解度、颜色以及显色反应的速度6.干扰离子的影响(1)与显色剂反应生成有色化合物(2)干扰离子本身有颜色(3)与显色剂反应生成无色化合物(4)与被测

18、离子结合形成离解度小的另一化合物7. 干扰的消除（1）加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂：）加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂： 使干扰离子生成无色配合物或无色离子。（2）选择适当的显色条件以避免干扰：）选择适当的显色条件以避免干扰： 用磺基水杨酸测定Fe3+离子时,Cu2+与试剂形成黄色络合物, 干扰测定, 但如控制pH在2.5左右，Cu2+则不与试剂反应。（3）分离干扰离子；）分离干扰离子；（4）在不同波长处测量被测离子和干扰离子形成的有色化合）在不同波长处测量被测离子和干扰离子形成的有色化合物的吸光度。物的吸光度。7.3.4 三元配合物在光度分析中的应用特性简介 由一种金属离子同时与两种不同的配

19、位体形成的三元配合物具有下列分析特性：1. 稳定，可提高分析测定的准确度和重现性；稳定，可提高分析测定的准确度和重现性； 例: Ti-EDTA-H2O2三元配合物的稳定性，比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的稳定性，分别增强约1000倍和100倍。2. 比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度；比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度； 灵敏度通常可提高12倍，有时甚至提高5倍以上。3. 比二元体系具有更高的选择性；比二元体系具有更高的选择性； 减少了金属离子形成类似配合物的可能性。4.三元配合物形成条件易于控制；三元配合物形成条件易于控制；5.三元配合物具有较好的萃取性能。三元配

20、合物具有较好的萃取性能。7.4 吸光度测量条件的选择7.4.1 选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般应该选择max为入射光波长。 如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。 如图选500nm波长测定，灵敏度虽有所下降，却消除了干扰，提高了测定的准确度和选择性。7.4.2 参比溶液的选择 为什么需要使用参比溶液？为什么需要使用参比溶液？ 测得的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。测得的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。试液参比IIIIAlglg0 选择参比溶液所遵循的一般原则：选择参比溶液所遵循的一般原则： 当试液、显色剂、条件试剂均无吸收时当试液、显色剂、条

21、件试剂均无吸收时，用纯溶用纯溶剂（水剂（水) )作参比溶液；作参比溶液； 若显色剂或若显色剂或条件条件试剂在测定波长处略有吸收试剂在测定波长处略有吸收, ,而试液本身无而试液本身无吸收，吸收，用用“空白空白溶液溶液”(”(仅仅不加试样溶液，不加试样溶液，其它与显色试液相同其它与显色试液相同的溶液的溶液) )作参比溶液；作参比溶液； 当试液中其他成分有吸收，但不与显色剂反应，同时显色剂当试液中其他成分有吸收，但不与显色剂反应，同时显色剂无吸收时，无吸收时，则可用试则可用试液溶液作液溶液作参比溶液；参比溶液；当试液中其他成分有吸收，但不与显色剂反应，同时当试液中其他成分有吸收，但不与显色剂反应，同

22、时显色剂显色剂有有一点一点吸收吸收, ,则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。加显色剂，作为参比溶液。（5 5） 当试液中其他成分与显色剂反应形成有色化合物时，当试液中其他成分与显色剂反应形成有色化合物时，可可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。参比溶液。7.4.3 吸光度读数范围的选择不同的透光度读数，产生的误差大小不同： lgT= bc微分：dlgT0.434dlnT = - 0.434T -1 dT = b dc 两式相除得：c/c不

23、仅与仪器的透光度误差T 有关，而且与其透光度读数T 的值也有关。是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？TTT.ccdlg4340dTTT.cclg4340最佳读数范围与最佳值:设：设：T =0.5%， c/c T 关系曲线关系曲线T 在在 10%70% 之间时之间时, 浓度相浓度相对误差较小。对误差较小。浓度相对误差最小时的透光度浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：为： Tmin 36.8%, Amin 0.434 通过改变吸收池厚度或待测液浓度，使吸光度读数处在适宜范围。 分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定。7.5 吸光光度法的应用7.5.1

24、普通分光光度法普通分光光度法1.1.单组分的测定单组分的测定 A- c 标准曲线法定量测定。标准曲线法定量测定。2.2.多组分的同时测定多组分的同时测定 各组分的吸收曲线不重叠各组分的吸收曲线不重叠 各组分的吸收曲线互有重叠各组分的吸收曲线互有重叠根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 A1 = a1 bca b1bcb A2 = a2 bca b2bcb 7.5.27.5.2一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HLHLHLL=HL+LKccAKK +L+aaa(HL)H (HL)=+H +H KaH+L/HL高酸度下

25、，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：代入整理：AAKAA +HLaL-=H -HLLL HLAAKAAa-p= pH+lg-或配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A.7.5.3 双波长分光光度法两束光交替照射：两束光交替照射：bcAAA)(2121试液本身作参比液。试液本身作参比液。主要应用：主要应用：(1)多组分混合物的测定(2)混浊样品的测定(3)反应动力学过程研究例例1 邻二氮菲光度法测铁邻二氮菲光度法测铁 : (Fe)=

26、1.0mg/L, b=2cm , A=0.38,计算计算 解：解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.010-3/55.85 =1.810-5mol/L4-1-1-50.38=1.1 10 L molcm2 1.8 10 例题2：相对摩尔质量为180的某吸光物质的= 6.0*103，稀释10倍后在1.0cm吸收池中测得吸光度为0.30，计算每升原溶液中含有这种吸光物质多少毫克？解：由题意稀释后的浓度为c=A/(b)=0.30/(6.0*103*1.0)=5.0*10-5mol/L原溶液的浓度c原=10c=10*5.0*10-5=5.0*10-4 mol/L则每升原溶液中含有这种吸光物质m= c原*M=5.0*10-4*180=0.09 mg/L7.6 紫外吸收光谱法简介 7.6.1 有机化合物电子跃迁的类型有机化合物电子跃迁的类型 有机化合物三种价电子：有机化合物三种价电子：、n 电子电子。 分子轨道理论分子轨道理论： 外层电子均处于分子轨道的基态(成键或非键轨道)。外层电子吸收紫外或可见辐射后，从基态向激发态(反键轨道)跃迁。四种跃迁: n n 1.1.跃迁跃迁 所需能量最大。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外所需能量最大。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区区(max 104Lmol -1 cm -1以上，强以上，强吸收。不饱和烃、共轭烯