叶绿素的提取与分离

1、叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定班级：11级生科2班组员：XXX XX实验名称：叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定实验原理：叶绿体色素乂称光合色素，在高等植物中可分为叶绿素和类胡萝卜素两大类，前者包括叶绿素a （蓝绿色）和叶绿素 b （黄绿色），后者包括胡萝卜素（橙色） 和叶黄素（黄色），它 与 们 类盘体膜上的蛋白质结合形成 色素蛋白复合体， 不溶于水， 易溶于酯，因此可用丙酮、乙醇、石油醍等有机溶剂进行提取。层析的基本原理：在分离过程中，由一种流动相（即 一种液体或气体）带动着试样经过固定相（一种支持物，如 纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对 试样中不同成分的吸

2、附程度有别，当用适当的溶剂推动时， 混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的 移动速度不同，经过一定时间层析后，可使试样中的各种组 分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合色素中各种色素 分子的吸附程度不同，以及这些色素分子在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动色素分子向四 周移动时，各种色素分子沿纸扩散的速度也就不同，使混合 色素分离，出现不同颜色的环。将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿色，在反射光下呈樱桃红色，种这现象称为荧光现象。在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红色，是因为叶绿色分子吸收光能后处于激状 发 态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它回到基态时，将

3、所获得的能虽以辐射能的形式发射出红光虽子。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、局温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋 白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被 H +所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H + ） 乂被铜（Cu2+）取代，形成了铜代 叶绿素，便由褐色转变成蓝绿色，铜代叶绿素很稳定，且比 原来的绿色还要稳定些，在光下也不易被破坏。材料与设备试剂：1. 材料新鲜的菠菜或小白菜等其他绿色植物叶片。2. 设备电子天平、研钵、烧杯、虽筒、培养皿、刻度试管、试管夹、 试管架、酒精灯、剪刀、圆形滤纸、小漏斗等。3. 试 剂丙酮、四氯化碳、无水硫酸钠、6 mo

4、l/L盐酸、醋酸铜粉末、 碳酸钙等。方法与步骤：一、1.叶绿体色素的提取2. 取菠菜或其他植物新鲜叶片5g,洗净，擦干，去掉主脉后剪碎，放入研钵中。取材及实验前准备工作3. 在研钵中加入少虽碳酸钙和约3-5 mL丙酮后，研磨成匀浆，研磨过程中根据情况加入一定虽的丙酮以利于研 磨，匀浆用多层纱布过滤到试管中。4. 在残渣中再加入 35 mL丙酮，研磨过滤，共得深 绿色溶液近 10 mL,其中含有叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄 素、胡萝卜素等色素及其它脂溶性物质。二、1.叶绿体色素的分离2. 纸层析分离法具体操作为：1.先用条滤纸（2cmX 4cm沿长度方向卷成一个紧实的纸芯。取一张圆形层析滤纸（直

5、径，略大于培养血直径），在其中心位置钻一个纸芯粗度的圆形小孔（滤纸不能折叠），将卷好的纸芯一端插入孔内少许，并剪去纸芯上端多余部分，使纸芯上端与滤纸恰好平齐，下端长约 1.5 cm （与 培养血盖高度同）。2.把个这带纸芯的圆形滤纸， 平放在干净的培养皿上， 用细 玻璃滴管吸取少n叶绿体色素的丙酮提取液，小心地滴入纸 芯上端710滴。注意：一定要在色素斑点稍风干后，再滴 入另一滴，而且液滴不能污染滤纸。3. 向培养皿中倒入适虽（约为培养皿高度的 1/3左右）四氯化碳，并加入一勺（适虽）的无水硫酸钠，使纸芯下端浸入 其中，并立即盖上培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸芯扩散至圆形滤纸上，并把叶绿

6、体色素向四周推动，数分 钟后，就可见到滤纸上出现四或五个颜色不同的同心环，并 逐渐扩大。4. 当推动剂前沿接近滤纸边缘时（约30 min左右），取出 滤纸，即可看到分离的各种色素，用 笔铅标出各种色素 的位置和名称，并绘简图示之或拍摄图片。三、叶绿体色素的理化性质1. 荧光现象观察叶片丙酮提取液（稀释前的浓提取液）在反射光和 透射光下的颜色有何不同并拍摄图片。叶绿体色素溶液在反射光下呈樱桃红色，在透射光下呈绿色，说明原因光对叶绿素的破坏作用取叶绿体色素提取液少许，分装于2支试管中，一支放在黑暗处或用黑纸遮光）；另一支放在强光下（阳光直射），经0.51 h后，观察2支试管中溶液 颜色有何不同并拍

7、摄图片。2. 氢和铜对叶绿素中镁的取代作用取2个试管，A管中加入稀释后的叶绿体色素提取液2mL,作为对照；在 B管中加入稀释后的叶绿体色素提取液 5mL并加入12滴浓盐酸，匀摇，溶液变为褐色，拍摄图片, 此时叶绿素中的镁（Mg"）被氢（H。取代而生成了去镁叶 绿素。从B管中分出一半装人 C管，作为对照，在 B管余下的 溶液中加入一小粒醋酸铜结晶，将B管和C管都在酒精灯上慢慢加热，则 B管中的溶液乂转变在蓝绿色，拍摄图片， 这是因为其中的氢（H + ） 乂被铜（Cu2+）取代，形成了铜 代叶绿素。【注意事项】(1) 研磨叶片要充分，否则提取的叶绿体色素溶液浓度稀， 荧光现象不明显。(2) 纸层析时，纸芯一定要卷实，分离色素用的圆形滤纸 在中心打的小圆孔周围必须整齐，否则分离的色素不是一个 同心圆。(3) 色素的提取、展层均应在弱光或暗室内绿光下进行， 以防止光破坏色素，影响实验结果。(4) 实验用的有机溶剂较多，且都易挥发，取时动作要快、 取后要随时加盖。思考题(1) 图示叶绿体色素纸层析结果， 用笔铅分别标出叶绿素 和叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素。(2) 研磨提取叶绿体色素时加入CaCQ和石英砂各有什么 作用？CaCQ是为了保护