割手密种质资源遗传多样性的ISSR分析.doc

1、割手密种质资遗传多样性的ISSR分析p 摘 要 为探讨国内割手密种质资的遗传多样性，本研究采用ISSR分子标记对采自8省的52份割手密种质资进行了分析p 。结果表明，22条ISSR引物共扩增出127条条带，其中多态性条带121条，多态率达95.3。材料间遗传相似系数GS在0.600.91之间。UPGMA聚类分析p 结果表明：在遗传相似系数0.72时52份材料可分为4大类；ISSR分析p 结果显示，割手密遗传多样性丰富，可以用ISSR对割手密进行分子水平的鉴定和遗传多样性研究。【关键词】：p 割手密；遗传多样性；ISSR；SDS法中图分类号 S566.1 文献标识码 AGeic Diversit

2、y in Saccharum spontaneum L.Based on ISSR MarkersLIU Jianle1，2， BAI Changjun1 _， YAN Linling1， YANG Hubiao1ZHANG Long1，2， HUANG Chunqiong11 Tropical Crops Geic Resources Institute， CATAS / Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Utilization，Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China2

3、College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， ChinaAbstract In order to analyze the geic diversity of Chinese S.spontaneum L.， a toatal of 52 S.spontaneum L.was used and ISSR markers were apllied.With 22 ISSR primers， 127 loci were detected among which 121 were polymorphic， indicati

4、ng considerable geic variations at the species level.The geic similarity among all accessions was ranged from 0.60 to 0.91.The 52 S.spontaneum L.were clustered into four groups by UPGMA when GSC was 0.72.The study indicated that ISSR produced high polymorphism on S.spontaneum L.and could be used in

5、the study of the molecular evaluation and studies of geic diversity of the S.spontaneum L.germplasm.Key words Saccharum spontaneum L.； Geic diversity； ISSR； SDS methodsdoi 10.3969/j.issn.1000-2561.20_.01.012割手密（Saccharum spontaneum L.），又名甜根子草，为禾本科（Gramineae）甘蔗属（Saccharum）多年生草本植物1。割手密的适应性强，分布范围广，在我国北

6、纬18°1533°20，东经97°122°海拔12 460 m的地区均有分布2，是当前世界范围内甘蔗育种中抗逆性、分蘖性、适应性等优良性状的主要来3，但目前甘蔗育种面临亲本资匮乏，品种间遗传背景狭窄，盲目性、重复性等问题。因而从分子水平上揭示割手密遗传资的多样性，确立分子标记辅助育种技术非常重要。简单重复序列区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）PCR技术是1994年加拿大蒙特利尔大学的Zietikiewicze4提出的。其原理是在SSR的3或5端锚定14个核苷酸，进而对反向排列的SSR间的一段DNA 进行扩增。该技

7、术不仅克服了SSR和RAPD技术的某些缺点而且具有多态性高、重复性强、DNA用量少、操作简单、快速、高效等优点5。目前该技术已应用于甜橙6、扁穗牛鞭草7、狗牙根8、野牛草9、尤氏针茅10等植物种质资的研究，并取得了较好的成果。对于割手密，Chen等11通过分子聚类分析p ，推论出我国割手密起于云南。杨清辉等12选用6个随机引物对32份不同纬度、不同海拔、不同染色体数目的割手密作RAPD分析p ，结果表明，供试的32份割手密具有丰富的多态性，可划分为9个类群。樊丽娜等13对广东地区的67个割手密种质采用Genomic-SSR和EST-SSR标记分析p ，结果表明，广东割手密之间的遗传关系存在显著

8、地由南向北的地理分化，但利用ISSR分子标记技术对割手密种质资的研究尚未见报道。本研究应用ISSR技术首次对采集的52份割手密进行了遗传多样性分析p ，在分子水平上探讨了其遗传多样性，旨在对割手密种质资的保护鉴定、利用及以后的育种工作提供必要的参考。1 材料与方法1.1 材料及来本研究材料来自中国热带农业科学院热带作物品种资研究所牧草中心种质资圃（表1），20_年5月初齐地割掉地上部分，6月1号在每个资圃中随机挑选15株割手密，每株剪取幼嫩健康、无病斑的叶片若干，装入编号袋，用冰盒带回实验室，-80 条件下保存备用。1.2 方法1.2.1 DNA的提取 将SDS法改良用于提取割手密的DNA。（

9、1）取12 cm叶片剪碎，放入预冷的研钵中，用液氮充分研磨成粉末，将粉末状材料迅速转入灭菌的2 mL离心管，加入65 预热的SDS缓冲液800 L，颠倒离心5 min，使叶片粉末与提取液充分混合。（2）将混合液置于65 的水浴中加热1 h，每隔15 min摇动1次。（3）将混合液放入冰盒至常温，加入800 L酚 氯仿 异戊醇（25 24 1），轻轻晃动5 min。（4）4 ，11 000 r/min离心15 min，转移上清液于另一灭菌离心管中。加入750 L氯仿 异戊醇（24 1），轻轻晃动5 min。（5）4 ，11 000 r/min离心10 min，转移上清液于另一灭菌管中，加入等体积

10、-20 预冷的异戊醇，轻轻晃动5 min，-20 冰箱放置1 h。（6）4 ，11 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入4 预冷的70乙醇500 L，洗涤沉淀2次。将离心管置于吸水纸上，室温风干20 min。（7）加入100 L TE缓冲液溶解沉淀、加入1 L的RNAseA（10 mg/L），4 保存待测。1.2.2 ISSR引物筛选 ISSR所用引物为加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的100个引物序列，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。 用 A42（广东）、A48（海南）、A49（广西）3份材料作为DNA模板从中筛选出22条扩增条带清晰、多态性好的引物用于扩增反应。用A48作

11、为DNA模板对引物进行退火温度的PCR扩增，退火温度设为4757 ，PCR仪自动生成12个退火温度（47.0、47.7、48.5、49.3、50.4、51.4、52.5、53.6、54.7、55.6、56.5、57.1 ），1琼脂糖凝胶中电泳，电压120 V，电泳50 min，筛选出每个引物合适的退火温度。1.2.3 ISSR扩增反应体系 ISSR扩增反应体系经过优化后确定为20 L，反应体系如下：模板（100 ng/L）1.0 L、Taq酶（5.0 U/L）0.5 L、10×buffer 2.0 L、ISSR引物（10 mol/L）1.0 L、dNTP（10 mmol/L）1.4

12、L、MgCl2（25 mmol/L）2.0 L、无菌水补足至20 L。PCR反应程序为：94 预变性7 min；94 变性30 s，4757 （按不同的引物退火温度调整）退火45 s，72 延伸2 min，45个循环；72 延伸7 min。PCR产物在含有TBE的1琼脂糖凝胶中电泳，电压120 V，电泳50 min。以2 000 bp Maker为标准分子量对照，在Gene Genius Bioimaging System凝胶成像仪上照相。1.2.4 数据统计 ISSR为显性标记，图谱中的每一条带都视为1个分子标记。对ISSR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，记录扩增条带的有无，在电泳图上，有清晰条

13、带的记为 1，同一位置无带的记为 0，根据统计条带的结果建立原始数据（0，1）矩阵。利用NTSYS-pc 2.1软件，计算品种的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析p ，绘制树状聚类图。2 结果与分析p 2.1 ISSR扩增产物多态性分析p 从UBC公布的100条引物中筛选出22条能产生清晰条带、重复性好的ISSR引物对52份种质进行扩增，共产生127条大小约在1002 500 bp的条带（表2）。图1显示引物UBC 843对割手密部分材料的扩增结果。22个引物扩增的条带变化为8条（UBC853和UBC892）到4条（UBC854和UBC855），平均每个引物能扩增5.8条条带，多态性条带

14、平均5.5条。在扩增出的127个条带中，其中121条具有多态性，多态百分率（PPL）为95.3，表明割手密种质资中具有丰富的遗传多态性，运用ISSR标记可以很好地揭示参试割手密种间或种内的遗传差异及亲缘关系。2.2 ISSR标记的遗传相似性分析p 利用NTSYS 软件计算52份割手密材料间的Nei-Li相似系数GS，52份割手密的遗传相似系数在0.600.91之间，平均GS为0.73。从种质的遗传相似系数可以看出（表3），在52份割手密材料中，A41和A16的遗传相似系数最小（0.60），表明 A41和A16的亲缘关系甚远，遗传差异较大，存在较大的遗传多样性。A26和A13的遗传相似系数最大（

15、0.91），表明A26和A13的亲缘关系较近，遗传差异较小。从割手密遗传相似性分析p 可知，野外采集的52份野生割手密存在较大的遗传多样性和种内遗传相似性。结果再次表明，这52份割手密种质存在丰富的遗传多样性。2.3 ISSR标记的聚类分析p 利用NTSYS-pc 2.1软件，计算材料间的遗传相似系数，通过UPGMA法进行聚类分析p （图2）。在遗传相似系数0.72时可分为四大类。第类包括26份种质，是最大的一个类群，其中6份来自云南，5份来自广东，7份来自广西，7份来自海南，1份来自福建。其中A51和A52遗传相似系数为0.90，说明它们的亲缘关系很近。第类包括23份种质，其中8份来自海南。

16、第类只包括A24（广西）1个材料。第类包括A15（贵州）和A16（江西）2份种质。在遗传相似系数0.735时可将第类分为两个亚类。第一亚类包括云南的A1和A9，广东的A3、A10和A12，海南的A7、A8、A13、A14和A18，以及广西的A11和福建的A6。第二亚类包括云南的A4、A5、A22和A19，广西的A17、A20、A21、A49、A50和A51，海南的A47和A48，广东的A2和A52。从图2可见它们之间的遗传聚类与其地理来没有严格的一致性。3 讨论与结论3.1 ISSR标记刘洪博等14用SSR分析p 云南割手密的遗传多样性，共扩增出233条条带，多态性比率为89.0。王英等15采

17、用ISSR分子标记技术对96份甘蔗种质资的遗传多样性进行了分析p ，利用7条多态性较强的引物共扩增出85条多态性条带，其种质的遗传相似系数在0.150.19之间。本实验首次采用ISSR对我国南方地区的割手密种质资的遗传多样性进行分析p ，在扩增出的127个条带中，其中121条具有多态性，多态百分率（PPL）为95.3，遗传相似系数在0.600.91之间，平均GS为0.73。综上所述，本实验的割手密的ISSR标记表现出了较高的多态性（95.3），表明割手密种质资具有丰富的遗传多态性，在分子水平上差异较大。本试验与以上研究结果略有差别，有差别的原因可能是研究材料和研究方法的不同造成的16。Prev

18、ost A只用了4个ISSR引物就将安第斯亚种的34个马铃薯品种分开了17。刘莉等18从50条ISSR引物中选出的7条引物均能扩增出清晰条带，并将20份野牛草单株区分开。本试验利用22条ISSR引物能够将52份割手密材料分开，并利用UPGMA法进行聚类将供试材料划分为六大类。再次证实了ISSR标记技术在割手密遗传多样性分析p 中是一种效率高、重复性好的分子标记技术，适合割手密种质遗传多样性的研究，这与王英等得出ISSR分子标记技术用于甘蔗属遗传多样性的分析p 是可行的结论一致15。3.2 聚类分析p 从供试材料间的聚类分析p 可以看出，52份割手密的遗传聚类与其地理来没有严格的一致性，产生这种

19、现象的原因可能有两个：一是地区之间存在种质资的交换，二是不同地方品种来地的小生境可能存在一定的遗传相似性。特别值得注意的是，A23（福建）与其它供试材料差异明显，单独为一类。与同为福建的A28并没有聚为一类，其原因可能是地理位置导致了基因的变异，A23靠海边，A28靠近山区。本研究用ISSR分子标记技术对52份割手密材料进行遗传多样性分析p ，从分子水平上验证了这些割手密的分类，明确了它们之间的遗传相似性。采集的52份割手密的遗传多样性不仅丰富而且其遗传关系与地理来无严格一致性。因此，应加强割手密种质资的原生境和异地保护力度，以及加大选育优良割手密的进度，为割手密种质资的保护鉴定和甘蔗的育种、

20、能草的选育做好准备。【参考文献】：p 1 刀志学， 白史且， 常 丹， 等.割手密的分子标记应用进展J.草业与畜牧， 20_， 203（10）： 16-19.2 杨清辉， 李富生， 肖凤回， 等.割手密RAPD指纹图谱分析p J.云南农业大学学报， 1998， 13（4）： 348-350.3 黄忠兴， 周 峰， 王勤南， 等.国内外割手密资农艺性状表型遗传多样性分析p J.植物遗传资学报， 20_， 13（5）： 825-8294 Zietikiewicze， Rafalske R A， Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence re

21、peat（ISSR）anchored and polymerase chain reaction lificaionJ.Genomica， 1994， 20： 178-.5 Shen J， Ding _， Liu D， et al.Intersimple sequence repeats（ISSR）molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium of ficinale KIM URA et MIGOJ.Biological and Pharmaceutical Bulletin， 20_

22、6， 29（3）： 420-422.6 黄晓丹.甜橙种质资的ISSR标记研究D.杭州： 浙江大学， 20_6： 27-33.7 范 彦， 李 芳， 张新全， 等.扁穗牛鞭草种质遗传多样性的ISSR分析p J.草业学报， 20_7， 16（4）： 76-81.8 刘 伟， 张新全， 李 芳， 等.西南区野生狗牙根遗传多样性的ISSR标记与地理来分析p J.草业学报， 20_7， 16（3）： 55-61.9 邓春婷， 包满珠.野牛草实生群体多样性的表型及ISSR分析p J.草业科学， 2021， 25（1）： 100-105.10 隋晓青， 王 堃.克氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化J.草业学报， 2021， 17（3）： 71-78.11 Chen