冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述

1、冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述综述2013.6 陈亚飞摘要：冷冻十燥技术是生物制剂的主要生产工艺， 采用冷冻十燥工艺可保持产品 原有的理化性质和生物活性，且有效成分损失极少。十燥后的产品形状、体积、 晶型等理化指标均一性好。产品因含水量低而易于长期保存，因疏松多孔而使得 加水后可迅速完全溶解。但在冻十制剂的生产或实验中我们总会有一些冻十上的 问题，下文就是我们在冻十制剂上的主要问题的分析。关键词：制剂预冻共晶温度玻璃态转化崩解温度十燥稳定性水分保护剂 一冷冻十燥技术1冷冻十燥技术的发展随着真空泵和制冷机的出现，冷冻和十燥理念的结合，近些年来冷冻十燥技 术在全世界发展迅速，应用非常广泛。冷冻十

2、燥技术的发展史已经白年有余， 从 最初发现冷冻十燥技术，以及真空条件下水的饱和蒸汽压于水的温度关系，到采用主动加热方法减短十燥时间并用于生产化。1958年的第一届冷冻十燥会议促进了冻十的发展，在食品、药品、建材等行业得到广泛应用。近些年来，伴随着 电子计算机和传感测量技术在冻十领域的应用，冻十技术已加入高新技术领域行 列。人体器官的保存和再植的研究，营养保健食品的追求，超轻隔热陶瓷在航天 飞机的应用，以及低温超导材料等纳米级超细微粉材料的制备，都需要真空冷冻 十燥技术和设备。在医药领域中，真空冷冻十燥技术对药品和医疗事业都有重要 应用。药品方面上包括生物制品（活菌菌苗、活蠹疫苗、一些生物制品和

3、生化药 品等）、化药生产（多位注射剂：抗生素药、循环器官用药、中枢神经用药、维 生素类和肿瘤用药等）、中药生产（中草药、中成药）；医疗事业上对保存血液、 动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官上效果良好。2冷冻十燥的定义及优缺点简述冷冻十燥是指将被十燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升 华性能，使物料低温脱水而达到十燥目的的一种十燥方法。 是将热能通过与物料 接触的壁面以传导方式传给物料，使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而 十燥的操作。冷冻十燥过程物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它十燥后 体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。升华吸收热量会引起产品本身 温度的下降而减慢

4、升华速度，为了增加升华速度，缩短十燥时间，必须要 对产品进行适当加热， 整个十燥是在较低的温度下进行的。冻十有很多优点， 低温低压下许多热敏性的物质像蛋白质、微生物之类不会发生变性或失活，微生 物的生长和酶的作用无法进行，可保持原来的性状，真空下氧气极少，易氧化的 物质得到了保护。干燥能排除95-99%以上的水分，使干燥后产品能长期保存而 不致变质。在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小， 干燥后的物质 呈海绵状疏松多孔，加水后速溶完全，几乎立即性状复原。冻结状态进行干燥可 使体积几乎不变，结构不变，不浓缩，原本的溶解物质在物料中分配均匀且升华 不析出，防止表面硬化。冻干过程污染机会少

5、，易实现无菌操作。冻干有几点缺 点：溶剂不能随意的选择，特殊晶型制备很困难，一些产品复溶会混浊，冻干时 问长成本高。3冷冻干燥的原理介绍水分在物料中存在有两种方式，一种是游离水（自由水），冷冻干燥中的主 要对象，自由水与物料主要以吸附和渗透的形式结合，大量存在与物料的表面、 毛细管、孔隙中，冻干时稍低丁 0C就结冰，以升华的方式被除去。另一种是结 合水，以化学结合水形式存在丁物料的组织中， 结合力强，在-50 C到-60C条件 下才能冻结，一半在冻干后期，随温度的增加以蒸发的形式被除去。 升华过程可 用水的三相图图1来说明，水在不同的温度和压力下，以气态、液态或固态存在。 在相图上，三相点。点

6、以上，可能以固、液、汽三态之一的状态存在，而在三相 点以下，只有固汽两相。水的三相点参数为温度 0. 01C，压力610Pa。在610 Pa以下给冰加热，就可直接升华为水蒸汽。纯水可在0C固化结晶，各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液， 其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全 冻结的温度为其共晶温度。不同物质或同一物质含水量不同时其共晶温度也各有 不同，需经实验得出。00.D1图1水的三相图及产品冻干后结构图二预冻条件的优化预冻过程在很大程度上决定了十燥过程的快慢和冻十产品的质量，产品预冻的效果由三个参数确定：预冻最低温度、预冻速率和预冻时间。预冻条件的优化 需要我们做到针对自己使用的冻十机

7、性能和三个参数优化中找到适合的条件。 1预冻最低温度的确定目前，在预冻温度的确定上很多生产厂家和实验部门没有给予足够重视，随着冻十生产量的不断扩大，盲目的深度预冻将造成能源的浪费和升华十燥时间的 消耗。预冻温度和共晶温度密切相关，我们熟知纯水可在0C固化结晶，但各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液，其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度（Te,共熔点）。不同物质或者同一物质含水量不 同时其Te各有不同。纯水没有带电离子是不导电的，含有物料的溶液中有带电离 子，当物料中水分被冻结，带电离子也会被固定住，导电能力急剧下降，物料的 电阻也急剧增加。根据此原理，利用Te的测定设

8、备测定物料降温冻结过程中与冻 结后的物料升温融化过程中电阻值的变化最剧烈时对应的温度就是物料的Te。此设备包括万用表、铜电极、物料池、热电阻、温度显示仪五个部件，如今市场上 已有代测共晶温度或出售测量设备的卖家。一般预冻结温度比T®氐8C10C就可以，保险起见可以比Teffi 15C就应该没问题。多数产品的T/-15C-25 C之 问，若没有条件知道产品Te, 一股预冻最低温度定在-40 C-35 C比较合适。对 于瓶装产品，小瓶在温度剧变时可能会发生掉底现象，我们曾做过一组预冻试验， 在其它条件完全相同的前提下，倒锅底形“？”凹底小瓶几乎无掉底现象，圆弧 “ n”凹底小瓶掉底现象明

9、显增多，而平底“-”小瓶则掉底严重。所以选瓶时 应试验瓶底对冷冻温度的耐受程度，选择最适宜的温度，以免造成损失。2选择适宜的预冻速率冷冻时形成的冰晶大小会影响十燥速率和十燥后产品的溶解速度，我们必须要根据产品的不同经试验得出一个最佳的冷冻速率。 通常介绍冻十理论的书籍都 会提到，降温速率越大，溶液的过冷度和过饱和度愈大，临界结晶的粒度则愈小， 成核速度越快，容易形成颗粒较多尺寸较小的细冰晶。 因而冰晶升华后，物料内 形成的孔隙尺寸较小，十燥速率低，但十后复水性好，这就是快冻；相反，慢速 冻结容易形成大颗粒的冰晶，冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大，有利于 提高十燥速率，但冻十后复水性差。有人

10、曾经质疑过这条理论是在受热均匀的前 提下得出来的，比较理想，而生产中和实验中的冻十机所提到的冻十条件没有那 么理想，在丁香园论坛上看到一位叫tinybayonet的说法，他把快冻慢冻分为以 下几类：1）、板温降得较快，且板温比产品温度低很多，则制品底部先冻结产 生结晶，但上部液体仍较热，所以不至于瞬间全部结晶，结晶会缓慢生长，就得 到了慢冻的效果。2）、板温降得较慢，板温与品温相差不大，则制品整体均匀 降温，并形成过冷，当能量积累足够时，瞬间全部结晶，得到了快冻的效果。3）、 板温降得很慢，并在低于共熔点的适宜温度保持（或缓慢降温），则制品形成较 小的过冷度，液体中先出现少量结晶，继续降温结晶

11、生长，得到大结晶，这即是 真正的慢冻。4）、制品浸入超低温环境（如液氮），整体瞬间结晶，形成极细 小的晶体（或处于无定形态），这即是真正的快冻。我比较赞同他的观点，企业 在大多数情况下采用瓶冻的冻十方法的，瓶冻的受热不均匀现象很明显。样品进入冻十箱前的温度越高，样料液上下部分的温度梯度越大，冰晶生长 速度越慢。溶液若慢速降温，则形成冰晶比较粗大，冰界面由下向上推进的速度 慢，溶液中溶质迁移时间充足，溶液表面冻结层溶质积聚也就多。 因而导致上表 层的溶质往往较多，密度较高，而下底层密度较小，结构疏松。同时，在不同的 预冻温度下冻结的样品，十燥后支架孔径大小有明显差异。 预冻温度愈低，支架 孔隙直

12、径愈小。这种分层现象乂叫溶质效应，在骨架差的制品上体现得最为明显， 或者底部萎缩，或者中间断层，或者顶部突起，或者顶部脱落一层硬壳，不一而 足。溶质效应是由于水的冻结使间隙液体逐渐浓缩， 从而使电解质浓度增加，引 起蛋白质的变性和细胞脱水，导致细胞死亡。溶质效应在水的冰点和共晶点之间 这一温度范围最为明显。若能以较高的冷冻速度越过这一范围，则可大大削弱溶质效应。在实践中，也有人提倡使用三步法，即将样品从室温先冷却至样品的初 始冻结温度；停止降温过程，使样品内温度自动平衡，消除其内的温度梯度；然 后再迅速降温，由于此时样品整体温度离结晶温度较近，且样品在冻结过程中， 样品温度下降较慢，故样品在冻

13、结过程中温度梯度会相对较小， 冰晶生长速度必 相对较快。如此，便提高了预冻速率，解决了溶质聚集在上层的问题。不过，并 不是所有的品种使用了三步法后都能取得明显效果的。3预冻时间该如何确定适宜的预冻时间可确保抽真空之前所有的产品均已冻实，以不致因抽真空而 喷瓶为前提。由于物体的传热为先表层后内部，冻十箱内的产品不可避免地存在 一定的温度梯度，这就需要依靠相应的保温时间和改善传热效率来缩小温度差 异。将盘装冻十改成抽底盘冻十，让玻璃瓶直接与板层接触，不失为改善传热的 好办法。多次试验表明，采用抽底冻十，产品温度下降明显增快，在样品达到预 冻最低温度后，保温11.5小时即可。目前实验室冻十机可以采用

14、抽底冻十方法， 但生产用的大型冻十机大多数还没有采用这种方法，保温时间要在 24h。 三十燥阶段 1十燥阶段条件升华十燥的时间长短与产品的品种及分装的厚度以及升华时提供的热量有 关，在产品品种及分装厚度已定的情况下，若要缩短时间，保证质量，就必须从 加速热量传递着手。冻十箱的板层是产品获得热量的来源，而箱体内的压强则是 产品获得热量的环境条件。长期以来，由于国产冻十机的性能较差，各企业问乂 缺少相互交流，总以为冻十箱内的压强越低越好， 其实并非如此。压强低当然有 利于产品内冰的升华，但若压强过低，则对传热不利，产品不易获得热量，升华 速率反而降低。而当压强过高时，产品内冰的升华速度减慢，产品吸

15、收热量将减 少，于是产品自身的温度上升，当高于共溶点温度时，产品将发生溶化造成冻十 失败。那么什么样的压强较合适呢，经验证明，冻十箱的压强在1030Pa时，既有利于热量的传递，乂利于升华的进行。而要将压强严格控制在这个范围之内， 没有好的冻十设备是不行的。目前国产冻十机多数没有此控制装置， 加上控制检 测仪表的灵敏度较差，使升华速度受到很大影响，所以若使用国产冻十设备，必 须将各主要部件进行适当地调整改进, 并增加真空控制装置,这样将大大缩短升 华时间。在解吸阶段，产品内冻结冰已不存在，因而可以将产品温度迅速上升到设定 的最高温度，这样既有利于降低产品的残余水份， 也可以缩短解吸十燥时间。从

16、理论上讲，一旦产品内冻结冰升华完毕，产品的十燥便进入了解吸阶段，而在实 际操作中，如何界定产品的两个十燥过程,则很难把握。另外，在什么时候迅速 提高产品温度，对玻瓶的影响最小，也应加以考虑。经过多次试验探讨之后，我 们基本可以认定，正常情况下，产品在到达0C时已进入了解吸十燥阶段；而在0C 以上时即使温度迅速上升，对玻瓶的影响也相对较小。为了确保冻十产品质量，在冻十全过程运行即将结束前进行压力升高试验是 很有必要的。具体方法是：关闭冻十箱和冷凝器之间的阀门，注意观察冻十箱压 力升高的情况，如果冻十箱内的压力无明显升高， 说明十燥已基本完成，冻十可 以结束；如果压力明显上升，则说明还有水份逸出，

17、还需继续进行十燥，直至再 次试验时，压力无明显上升为止。一般在关阀后3060秒内，压力上升不超过3 8Pa,此时产品含水率通常约在0.4%2咆问。在产品出箱前，箱内温度最好回 复到室温，这样可避免产品出箱后冷却吸湿，另一方面也不会对房间温度造成大 的波动。2十燥阶段的水分控制十燥过程对水分的控制是保证冻十制剂质量的关键，说到水分控制我们必须 先引入玻璃态转化温度（Tg）的概念，有些液体非晶态物料在被冷却固化过程中 不经过相变，而是连续地固化成玻璃体，这个过程称为玻璃化转变，所对应的温 度称为Tg。当物料到达这一温度时，很小的温度就可能引起冷冻浓缩液黏度的显 著增加，同时冰的结晶停止。无论是第一

18、、第二十燥阶段还是贮存中的制剂温度 都必须控制在Tg以下，否则冷冻浓缩液将会发生流动，破坏了冷冻建立起来的微 细结构，就会发生塌陷。对于冻十制剂药品水分含量的控制，水分含量越低，其 Tg越高，药品越能长期稳定地储存，通常冻十制剂的水分含量要求控制在1%3%之间，以保持稳定。用动力学方程计算可以选择冻十终产品更合适的水分含 量，既能满足药品在保存期稳定的要求. 乂避免在生产中因过度十燥而引起能源 浪费。另外，有研究表明瓶子的胶塞氯丁基橡胶塞要比漠丁基橡胶塞对水分的透 过率高，故除了要选择适宜的湿度环境保存，也要选择合适的包装材料。冻十制剂在一次十燥后往往都要进行二次十燥， 二次十燥乂叫解析十燥，

19、主 要十燥一次十燥残留的一些未被冻结的吸附水和结合水，这些靠升华无法去除的水分要靠蒸发来去除，这部分水分一定量时会为微生物生长和某些化学反应的进 行提供了条件，所以必须得到去除。最终冻十制剂含水量偏高主要原因1 ）解析 十燥时间太短，十燥温度太低；2）十燥层和瓶塞的流动阻力太大，半压塞太深， 水蒸气不易析出。3）装量太厚，一般是10-15mm不宜超过15mm 4）产品贮存 期间，水蒸气通过瓶塞等包装不密封处进入。3干燥阶段塌陷(崩解)温度(Tc)冻干产品在升华干燥阶段，随着升华时间的增长，产品中会出现已干层和冻 结层，这两层之间的交界面是升华面， 随着升华的进行，升华界面不断向减小冻 结层方向

20、移动，干燥层厚度逐渐增加。已干层产品结构应该是疏松多孔的，并保 持在稳定状态，以便冻结层升华出来的水蒸气顺利通过， 是全部产品都能干燥良 好。但某些已干燥的产品当温度升高到某一数值时，会失去刚性，变成粘性，发 生类似塌方的崩解现象，使干燥产品失去疏松多孔的状态，堵塞了冻结层产品水 蒸气升华逸出的通路，妨碍了升华的继续进行。丁是升华速率变慢，由搁板供给 冻结层的热量将有剩余，引起冻结层产品温度上升，当温度上升到共晶点温度以 上时，产品就会发生熔化或产生发泡现象， 致使冻干失败，这时的温度叫崩解温 度。有些产品的崩解温度高丁共晶点温度，升华时只需要控制产品温度稍低丁共 晶点温度即可；有些产品的崩解

21、温度低丁共晶点温度，这样的产品应以控制崩解 温度为准，在较低的温度下升华，势必要延长干燥时间。产品的崩解温度取决丁 产品本身的物性和保护剂的种类。混合物的崩解温度取决丁各组分的崩解温度。 因此在选择产品的冻干保护剂时，应该选择具有较高崩解温度的材料，使升华干 燥能在不太低的温度下进行，以节省冻干时间和能耗，提高生产率，降低成本。产品的崩解温度不好测，只有在冷冻干燥显微镜下直接观察得知，表1给出一些物质的崩解温度值。表1 一些物质的崩解温度物.硝泅度(%)E博珠550-25GABA10-Jfl' 20r制型械1D-38"-4QKasCl10-2r-22乳概10一1旷一19KC1

22、10-111 -11当fti要10髓些10-2&，2710拘*眼10!T矿一44IO-5te ill.10-210莽堀袖 lt10-31ft场血般5-3S-37PE10-o'-io弑坏血醒to古力*ig-3辆阿阳土褊脱IQ-W-S310U131酰畦10-3 JA1031将播妄额10-旷T91.0-33*-3§Z.SLBCL0-25EATA90-15tn *巴比罢10i*压制用5% 9810-4B'-40-44炼Ml5明般-3-32视皆-27-9咔精-50畔利斐臼-10-13ttrt/f.跚15上面我们共提到的温度点有共晶温度、崩解温度和玻璃态转化温度。一般来

23、说，崩解温度Tc比共晶温度T身肖高，也有少数产品崩解温度Tc比共晶温度T国氐。 共晶温度Te比玻璃转化温度Tg高。一般Tc要比Tg高205右。DSC传统的测定Te 和Tg的方法，迅速、精确、样品用量少、灵敏度高。Tc只能通过冻十显微镜测得。 值得注意的是，有些物料没有或不需要研究Tg,有些物料没有Tc。这几个温度参 数只与物料的成分、性质和加入的添加剂成分、性质有关，受工艺过程参数影响 不大。对于具体物料，如果查不到需要的有关数据，这时测试相关的参数是有必 要的，而研究这些参数的测试方法和测试结果的正确性是很重要的。四冻十辅料探究1冻十溶剂冻十的常用辅料包括溶剂和冻十保护剂， 在说到冻十保护剂

24、前，先了解一下 溶剂，常用溶剂包括注射用水、乙醇、丙二醇、正丁醇、异丙醇、叔丁醇、聚乙 二醇。拿冻十粉针剂来说，冻十粉针剂的药物和所使用的各种辅料必须有极高的 纯度，且无微生物污染和蠹性成分。注射剂溶剂首选注射用水，当注射用水不能 满足药物性质和临床要求时，才会考虑其他非水溶剂。其中在冷冻十燥中常见的 有机溶剂是叔丁醇。在有机混合溶剂存在下，增加了低压冷冻十燥时药物的稳定 性，提高升华速率和缩短冻十时间等。由于非水溶剂的刺激性和蠹性，通常采用 一种或几种非水溶剂和注射用水的混合溶剂。乙醇作为溶剂浓度可高达50%丙二醇作为溶剂比甘油更好，溶解性也好，还可作为渗透性保护剂；聚乙二醇在制 剂中应用广

25、泛。我们主要来研究一下叔丁醇，叔丁醇在冷冻十燥中采用叔丁醇和水的系统 （3%-19%勺叔丁醇）为溶剂，可改变晶体特性，形成针状冰晶，提高十燥效率， 缩短十燥时间。叔丁醇作为冻十溶剂还有一个独特的优点， 其溶剂自身在冻结中 形成针状结晶，能改变溶质的结晶方式，利于升华。而当少量的叔丁醇加入到水 中形成叔丁醇-水共溶剂后，在可以改变水的结晶状态，在冻结过程中形成针状 结晶，具有更大的表面积，同时冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻 力大大减小，升华速率显著提高，因此可用叔丁醇来加快冷冻十燥过程中的传质 过程。叔丁醇可以单独使用，也可以与水任意比混合形成共溶剂体系进行冻十。 单独使用时溶解水不

26、溶性药物或水中稳定性不好的药物。另外有研究以叔丁醇作 为溶剂溶解磷脂，经冻十后得到结构酥松的磷脂固体，加入水可以迅速水化制成 脂质体。这种方法类似薄膜分散法，可以制得粒径较大的微米级多室脂质体， 这 种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。目前更多是叔丁醇与水形成共溶 剂体系进行冷冻十燥的研究，其在药剂领域中应用总结起来主要在固体制剂 （难 溶于水的药物溶于叔丁醇中，水溶性物质溶解于水中，两者以适当的比例混合， 得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂，此溶液经进一步冻十可以 得到固体分散体。可加快药物升华速度，缩短冻十周期，提高药物稳定性，增溶 难溶性药物，简化制备固体分散体工艺，促

27、进药物的结晶。）、分散体系（脂质 体制备、非离子表面活性剂囊泡的制备、高聚物胶团的制备等）、工艺路线改进（蛋白质-多肽的磷脂分散体的制备、难溶性药物在水中的溶解度等）三个方面。 理想的冻十溶剂需要如下条件：凝固点高、挥发性强、最好能与水混溶。众多有 机溶剂中，叔丁醇被认为是最适合的冻十溶剂，主要原因如下： 凝固点高， 纯的叔丁醇在室温下（25 C）就可以冻结，与水混合后也可以在零下几度冻结， 在现有的冻十机中都可以完全冻结。 其他的一些有机溶剂如乙醇等凝固点低， 一 股都在零下几十度才能冻结，一般的冻十机无法将其冻结捕获，最终都进入到真 空泵中，因而在实际生产中无法使用。 叔丁醇的蒸汽压较高，

28、蒸汽压高有利 于升华，节省冻十时间，而另一种有机溶剂二甲基业碉，尽管凝固点在18.4 C, 但蒸汽压较低，升华困难，彳艮难用于冻十。叔丁醇与水可以任意比例混合，这点也很重要，可以增大一些脂溶性药物在水中的溶解度， 同时对一些水溶液中 不稳定的药物，加入适量的叔丁醇可以抑制药物的分解， 增强药物的稳定性。而 环己烷虽然在室温条件下也可以冻结（6.5 C）,但几乎与水不互溶，只能用于 脂溶性药物，极大的限制了它的应用范围。 叔丁醇蠹性低，作为药用的辅料， 叔丁醇的蠹性很低，在冻十过程中，大部分叔丁醇可在一次十燥阶段升华， 在制 剂中残留量很低，可以安全的用于制剂生产中。采用叔丁醇 -水共溶剂为溶剂

29、进 行冷冻十燥的工艺可以用于多种制剂的制备，在很多方面具有优势。对这项技术 进行深入研究，对药剂学基础理论和实际应用具有重要的意义。2冻十保护剂加入冻十保护剂的目的是为了提高冻十产品的质量： 赋形剂，可使固体物质 的质量分数在4%-25慌问，冻十后形成疏松团块结构；胶状物质可防止冻结前溶质沉淀和冻十后发生破碎；一些物质可做pbffi调节剂，提高崩解温度使产品易于 十燥；抗氧剂可改善产品的贮藏稳定性和提高其贮藏温度；一些抗冻剂或保护剂可防止一些具有生物活性或病蠹等因细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩的等而 死亡；一些保护剂可减小或抑制储存过程中活性成分变化， 蛋白质的变性和聚集。 冻十制剂对保护剂

30、要求很高：纯度高，无抗原性，无蠹性；可形成均匀混悬液或 溶液，冻十后形成团块，不破碎；在冻十和储存期中对产品有保护作用，但不与 活性成分产生化学反应，不破坏药物的活性；其崩解温度和共晶点温度应尽量高， 以保证不形成玻璃化冻结外壳；易除热源，弓I湿性好；冻十升华时不起泡；十燥 后复水性好；不影响对冻十制品的检测。几种常用的赋形剂：2.5%-20%勺葡萄糖可减轻注射给药的疼痈感; 葡聚糖具 有较高的玻璃转化温度，能在酶蛋白分子周围形成玻璃态，从而保护酶分子免受 高温所引起的损伤；甘露醇(20%-90% w/w)作为载体可形成疏松结实的均匀骨 架，改善了制剂产品的外观；氯化钠早期常作为赋形剂，但单独

31、使用盐类冻十后 饼状物体积多明显缩小，并出现硬壳和脆散，现在已少用；山梨醇与甘露醇相似， 一般作为赋形剂；乳糖加入冻十溶液中可增加体积，并有助于冻十块状物的形成； 聚氧乙烯毗咯烷酮(PVP可明显提高蔗糖的玻璃转化温度Tgfi (P<0.05),高 分子量的PVR更好的抑制蔗糖结晶，并通过稳定糖的玻璃态结构，共同提高冷 冻十燥过程中蛋白和氨基酸的稳定性； 海藻糖为葡萄糖的二聚体，为稳定的非还 原性双糖，广泛用于血细胞等冻十保存，作为保护剂冻十的样品生物性能比较稳 定，保存时间长，是低温生物领域最佳的保护剂，它分子量较小，易于填充到蛋 白质分子空隙中，有效限制蛋白质分子内部的结构变化， 避免

32、失活，玻璃化温度 比蔗糖高，但未被各国药典收载；蔗糖在冻十粉制剂中是常用的骨架赋形剂， 在 蛋白质类药物冻十时,主要作为填充剂对粒子赋型；麦芽糖可作为冻十粉针剂的 赋形剂或脂质体、蛋白质的冻十保护剂；右旋糖酊 1,40 , 70可用于注射剂型。 抗冻剂甘油在较低温度下倾向过冷而不结晶，浓度一般为 40%过高十燥阶段易 产生气泡、融解现象。甘油使胞内体系的体积分数更容易达到玻璃态转化温度， 可阻止蛋白的伸展和沉淀，维持蛋白分子三维结构的稳定， 起保护蛋白作用。酸 碱度调节剂有柠檬酸，乳酸，柠檬酸钠，氢氧化钠，碳酸氢钠。增溶剂和其他附 加剂有聚山梨酯、卵磷脂等。3 一些保护剂在蛋白和多肽的冻十制剂

33、中的应用甘露醇是一种多羟基化合物，不仅可作为优良的骨架剂使用，也能兼作渗透 性调节剂及蛋白质的冻十保护剂。 氨基酸也是一种常见的蛋白质保护剂， 研究发 现，两种低浓度的氨基酸(谷氨酸和精氨酸)对PEErhlFNot2b的冻十保护作用非 常显著，可能是因为：二者一个是酸陛氨基酸，一个是碱性氨基酸，加人后使 制剂具有了更好的缓冲能力，提高了蛋白质在冻十过程中的稳定性； 氨基酸的 玻璃化转变温度相对高于非氨基酸缓冲剂，因此可能对冻十制剂的稳定性起到了 一定作用； 氨基酸的另一种可能的保护机制是在冷冻过程中与蛋白共浓缩， 从而起到了稀释和保护蛋白的作用；在冷冻和冻十过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之

34、间发生特异的相互作用，保护蛋白不变性。糖是最常见、使用最广泛的一类冻十保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂， 在冻十的各个阶段均能对蛋白质起到一定的保护作用。蔗糖和海藻糖都是二糖， 其中蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变以及冻十 过程中及储存期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。 蔗糖也有一个相对较高的玻 璃化转变温度，使其在冷冻状态下与蛋白质共浓缩，起到了稀释蛋白质的作用， 从而防止了聚合，并且维持蛋白分子的结构。另外蔗糖、海藻糖以及甘露醇上的 羟基能替代部分结构水,与蛋白中的球基和氨基结合形成的氢键使其在缺水的条 件下仍能保持原有结构，而不丧失活性。蔗糖具有比其他多元醇更优

35、越的水置换 特性。海藻糖的作用与蔗糖相似，但比蔗糖具有更高的玻璃化转变温度和更低的 引湿性，且更不具有还原性。4常用细胞冻十保护剂的应用海藻糖在对生物膜保存的研究中发现，海藻糖无疑优于其它糖。这并非说其 它糖类不能保护细胞膜，实际上蔗糖也能起到很好的保护作用，但它需要更高的 浓度。在一般的冻十保存中,糖类一般与大分子聚合物共同使用,原因是大分子聚 合物对细胞冻存过程中的相变没有影响，但可抑制细胞间的聚集和蛋白的融合， 而糖类则可降低熔点值(Tm)。在细胞冻十过程中，对细胞磷脂囊泡的保护有2个必 要条件：抑制囊泡问的融合，在十燥情况下降低Tnfi。在溶液状态下，此种物质的 Tnfi为-1 C，若

36、在不加海藻糖的条件下十燥，Tm上升到70C，若在十燥过程中有海 藻糖的参与，Tm被抑制到-20 C，冻十物质可维持在液晶状态并在复水过程中不 发生相变。大分子聚合物和糖类这2种物质的联合应用满足了细胞有效冻十的要 求。当然，越来越多的研究证明，只有进入到细胞内部，海藻糖在冻十时才能对胞 内蛋白和细胞膜起到有效的保护作用。聚乙烯毗咯酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)是一种多聚体，它对生物体或生物大分子具有非特异性保护作用；同时它也是一种非渗透性保护剂，在细胞冻十 保存中常与糖类一起，主要通过与糖类间的氢键作用和改变糖类的玻璃化温度发 挥作用,不同浓度和不同分子量的PVP勺作用

37、不一样。大分子量的PVR够更有效 地抑制蔗糖的结晶作用，通过稳定糖类的玻璃化结构，这些多聚物还可以提高共 同冻十的蛋白和肽类的稳定性。增加PVP勺浓度和分子量也可以增加非结晶型糖 类的物理稳定性。盐类在冻十中的作用 溶液在结冰时，其中的溶质浓度必然会慢慢增大，盐类 产生的电解质离子可明显降低其Tgfi，比如在10%勺葡聚糖、PVR乳糖和蔗糖的 溶液中加入2%勺NaC阿使Tgfi下降1418C。磷酸钠对Tgfi的影响较小，但是当将 10%勺PV骼液中加入1%狗磷酸钠可以引起在低温热能曲线中的第 2个玻璃化， 暗示了在冻十液中的相分离。电解质诱导Tg值变化的最可能的机制是它可以增加 冻十液中非冰冻

38、水的含量，而这非冰冻水起到了增塑剂的作用，并且降低了 Tg值。 有些盐类会分离蛋白和PV瞅合，在冰晶中把它们分成蛋白富集区和PVFW集相， 这一结果强调了在冻十保护液中减少盐加入量的重要性。为了获得在冻十前后形态一致和功能稳定的细胞，很多糖类或多聚物经常被 用做溶液冻融和冻十过程中非特定蛋白质和膜的稳定剂，它们既是有效的低温保 护剂，乂是很好的冻十保护剂，它们对冻结的影响取决于种类和浓度。但是细胞种 类很多，所含蛋白也不尽相同，而且物理化学性质各异，因此不同的细胞需要不同 的保护剂。在选择冻十保护剂的配方时，必须进行大量严格的试验，这对任何一种 细胞冻十工艺的探索都是一项极为重要的工作。五冻十

39、制剂稳定性研究我们这里只对多肽类和蛋白质的制剂的稳定性探究，多肽类药物冻十制剂在 生产和贮存过程中，经常会出现药物失活现象，有时在其制剂表面还会出现凹凸 不平或萎缩等现象，引起这些现象的因素很多。首先是上述中谈到的玻璃态转化温度(Tg),在生产过程的第1、第2十燥阶 段以及储存过程中，药物温度都必须低于与其浓度变化相应的 Tg,否则就会影响 制剂稳定性，从而影响冻十制剂的外观和内在质量。但十燥温度过低，十燥时间就 要延长。为了既保证药物在十燥过程中温度低于 Tg, 乂缩短十燥时间避免能源浪 费,最好的方法是提高药物溶液的Tg,即加入Tg高的保护剂，如甘露醇、海藻糖等。其次是上述谈到的水分控制，

40、冻十制剂中的剩余含水量 ，对于多肽及蛋白质 类药物稳定性的影响很大,尤其对其活性的复性影响最大。一般认为其含水量越 低，则TgB越高,该制剂越能长期稳定地储存，但并不是剩余含水量越低越好。研 究表明不同结构的多肽及蛋白质类药物的冻十制剂对于剩余含水量的需求是不 一样的。就某一种多肽或蛋白质类而言，剩余含水量过高过低都不利于其稳定。 追究其原因，可能是每种多肽类或蛋白质类药物都含有适合于一定剩余水分来稳 定的基团，剩余含水量较低或过度的十燥可使多肽分子的这些基团（如极性基团 或分子表面的氢键）变化而导致变性；过多的水分可使多肽及蛋白质类药物发生 氧化变质的几率增多而导致变性。因此，控制适宜于多肽

41、及蛋白质类药物的剩余 含水量,这既能满足冻十制剂在保存期稳定的要求，乂避免在生产中因过度十燥 而引起能源浪费。为了提高药品的稳定性，必须对药品在冻十过程中的损伤和保护机制进行进 一步的研究，优化冻十工艺。预冻过程中一般认为主要是由机械效应和溶质效应 引起。耶霞等研究了冷冻保护剂能避免超低温冷冻过程中的溶质效应。十燥阶段,应该在保证药物活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第2阶段再十燥。在该 过程中，为了将十燥应力的破坏作用降至最低需要加入十燥保护剂 ，包括保持玻 璃化的十燥剂，以保证多肽分子表面的单层水分子不受到破坏。十燥好的制剂出箱后要及时密封，否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩等 现象。

42、因此,十燥好的制剂在出箱前必须注意十燥箱温度要高于环境温度 ；需充入 高纯氮气进行保护；并尽快进行密封处理。随着冷冻十燥机的不断改进，目前多采 用箱内真空密封或充氮气密封。冻十保护剂及其保护机制：从上述生产工艺过程中笔者得知，冷冻十燥是一 个复杂的过程，其过程中产生冻结应力（包括枝状冰晶的形成，离子浓度的增加， pbfi的改变和相分离等）和十燥应力（主要是指移去多肽分子表面单层水分子）等 都会使多肽及蛋白质类药物变性。为了防止药物变性 ，通常都在其制剂配方中都 添加了不同的保护剂，加入的这些保护剂一般应具有吸水性差、玻璃转变温度高、 结晶率低和不含还原性基团等特性。 常用的保护剂见表2。通常认

43、为，无定型甘露 醇具有使多肽及蛋白质类药物稳定的作用，而结晶态的甘露醇则没有稳定功能， 如有文献报道，1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物 的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。而与 甘露醇或其它糖类相比，海藻糖的玻璃转化温度更高、引湿性和还原性更低，具有 更广阔的应用前景。氨基酸也是常见的蛋白质保护剂之一，在冷冻过程中，低浓度 的甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致 pH®的改变而阻止蛋白质药物变性。贮存温度可能是影响冻十药品稳定性的最重要因素之一。冻十药品贮存过程中，温度必须低于其Tg，如环境温度超过冻十制剂的Tg，药品的玻璃化状态

44、被破坏 分子运动加快，无定形成分结晶增加，会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色 等，同时制剂的多孔网状结构被破坏，复水能力减弱。但有时贮存温度不稳定比单 纯高温对药物活性影响更大。残留水分是乂一重要因素。总的来说，冻于品越十燥，含水量越低，其TgB越高，越容易长期稳定地保存，但过度的十燥会使某些药 品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。十燥后的药品必须封口保存，以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致，一般对活的微生物、蠹株、菌种要 求真空封口，对易氧化变质的药品可以采用充氮封口 ，一般药品可采用普通封口。 冻十药品长期贮存时，封口胶塞对药品稳定性也有影响，是由于水分经胶塞进入 瓶内使药

45、品中残留水分增加所致。高压蒸气灭菌时水分也可经胶塞进入药品中。六 冻十过程中和冻十后的一些问题汇总 1喷瓶现象喷瓶是影响冻十制剂外观质量的重要因素，喷瓶的原因主要在三个方面，药 液中的气泡、预冻、十燥速率。制品在分装过程中，当灌装机溶液分注入瓶中时，由于液体流速较快，形成 一定量的气泡存在于瓶内液体中，此时应将装瓶液体放置一定时间让气泡充分逸 出，否则旗袍被冻结在制品内部，当升华过程抽真空减压时，气体逸出带有部分 制品黏附于瓶壁上。冻结过程预冻温度不够低或保持时间不够长， 未能使溶液全部固化，真空升 华十燥时，溶液的温度至共晶点时，溶液和水同时结晶析出，液体沸腾，造成喷 瓶。应严格控制预冻温度

46、，预冻温度比共晶点温度要低15摄氏度保持23h,就可 以保证冻实。升温过快造成制品上下温差过大,下部制品的结晶不是从固体到气体升华, 而是从固体、液体到气体蒸发，形成喷瓶。这样就造成制品上不均匀、疏松，呈 海绵状的理想外观，下部则呈硬结和不规则的空穴， 严重时可造成产品报废。因 此应该严格控制升华十燥阶段特别是在共晶点附近的升温速率，均匀且不宜过 快。2结晶冻十箱在预先冷却时箱内有许多水分结霜于隔板上， 产品进箱时，霜从隔板 中掉入产品中结晶中心，从而使产品结晶。产品预先加塞或加盖，或者产品进箱 后再开机预冻。最近可能在研究全自动冻十机， 实现冻十后自动压塞，同时期待 着此设备能够解决不提前半

47、压塞，解决结晶问题。3掉底掉底发生在预冻抽空阶段，一般是未冻实的液体于真空下快速蒸发， 沸腾放 热时发生。放热时产品本身温度急降，达到共晶点温度，于瓶底接触的搁板层并 没有以上蒸发冷冻特性，玻瓶承受不了短时间的如此大的温度。 所以预冻阶段要 冻实。4破瓶玻璃瓶在均匀受热或受冷在一定温度下是不破碎的， 但在不同部位施加不同 温度形成一定温差，就会破碎。所以要缩小玻瓶各部分的温差， 在冻十曲线上体 现的是缩小隔板温度曲线和样品温度曲线之间的温度线差异。要控制样品温度和隔板温度的温差小于20C,既缩短了冻十周期，也解决了破瓶和脱底现象。当然 破瓶也和瓶子质量还有冻十机性能有关。5产品上升与真空度有关

48、，升华过程中，泵组真空度很大时，突然大开大蝶阀，箱内真 空度会大幅上升，从而导致产品上升，在操作过程中先慢慢打开大蝶阀， 再开罗 茨泵。6分层在升华过程中，停机10min以上或十燥箱漏气会导致分层，产品进箱时减检 查密封条有没有老化，在四周涂上真空脂。停电或断电后应立即关闭真空阀碟， 让产品处于真空状态。7产品外观产品外观良好表现在颜色均匀、孔隙致密、保持冻十前体积、性状基本不变、 形成海绵状块状结构。有时产品出箱前质量看上去很好，出箱不久就萎缩了，或出现空洞、碎块。 主要因为产品十燥不彻底，还残存冰晶、出箱后产品的温度压力均处于共熔点以 上，冰融化成水，水被周围的已十物质吸收，产生空洞萎缩现

49、象。十燥不彻底就 是十燥时间不够长或温度太低，或两者都有；要不然就是冻结速率太快、晶粒太 细，使升华速率变慢；或者冻结不彻底；或冻十后成品密封不好吸收了空气中的 水分而发生萎缩，可采用充氮气方法。产品出箱时是间隙很大的骨架结构，甚至是绒毛状结构，出箱后绒毛状结构 物质很快消散。原因是产品配方中所含的固体物质少，冻结时自由水结成纯冰， 所占体积大，升华后形成的空隙也很大，可有用的成分在升华时随水蒸气一起分 散，形成毛绒状物质，一遇空气会吸水蒸气而消失，应加入适量填充剂来解决。产品出箱时，出现泡坑、十缩、塌陷、空洞等缺陷。原因是冻结温度过高， 或时间太短，产品为完全冻结；或十燥阶段温度过高，压力过

50、大。使部分产品融 化所致。在尚未冻牢就抽真空升华，外部压力迅速降低引起鼓泡；熔化了的产品 产生蒸汽浓缩，就会萎缩；部分未十产品加热剧烈而熔化，将会使已十物体熔化 而成空洞塌陷。因此一定要冻实，升华不能超过产品的共晶点温度和崩解温度。产品在深度方向上颜色和孔隙不均匀，由于分装后搁置时间过长，溶液中部 分物质析出或不能溶解成分发生沉淀。产品外观的影响因素还包括溶液浓度、放气速度。溶液浓度一般控制在1015沱问，小于5%勺要加赋形剂，浓度太高的话应控制厚度，一般在1015mm 若溶液浓度大于30%!是，则制品易出现萎缩、塌陷、不饱满的情况。另外，十 燥时冻结的表面最先脱水形成结构致密的十燥外壳,下面

51、升华的水蒸气从已十燥 表层的分子之间的间隙逸出。这时如果溶液浓度太高，分子之间的间隙小、通气 性差，水蒸气穿过阻力较大，大量水分子来不及逸出，在十燥层停滞时间长，使 部分已十燥药物逐渐潮解，会使制品体积收缩，外形不饱满或塌陷。如果药液重 量浓度低于4%,在抽真空时，药物会随水蒸气一起飞散；或在十燥后变成绒毛 状的松散结构，在解除真空后，这种结构的物质会消散，使制品成空洞状。还有 一种情况是药液浓度太低，使制品疏松易引湿，同时由于比表面积过大，使制品 容易萎缩，十燥的成品机械强度过低，一经振动即分散成粉末而粘附于瓶壁。在 冻十工艺方面，如果药液厚度大于 20mm,十燥时间延长，也会造成产品外观不

52、 合格。另外，在开始冻结时降温速度快，使制品形成细结晶，密度大，升华受到 阻力较大，水分不易蒸发掉，制品会逐渐潮解致使体积收缩而造成外形不饱满或 形成团状。如果冻结速度过慢，冰晶成长时间较长，则易发生浓缩，致使药物与 溶剂分离、成品结构不均匀。措施：合理设计冻十溶液的配方。一般重量浓度在 4%25%之间为宜，最佳浓度在10%15%。若浓度低于4%,可适当添加赋形剂 （如甘露醇、右旋糖酊、乳糖等）。若浓度较高时，则必须控制冻十制品厚度，或 降低浓度，改用大的容器灌装药液。冻十过程中降温速度应控制在每小时降低 5C6C。在一期升华十燥阶段，制品温度应低于共熔点，升温不宜快，控制在 每小时5C左右。

53、如果加热过快，在制品有大量水分时，温度超过其共熔点，就 会导致制品溶化，外观出现缺陷。在二期升华阶段，虽然此时制品中含水量已较 低，升温速度可以适当提高，但要将温度控制在安全温度以下，否则会有结块。另外，制品包装的气密性不好，在有效期内也会出现外观不合格甚至内在质量不 合格。8水分（含水率）含水率在上面水分控制中提到，这里就不再说明。9其他问题有时我们的产品在冻后还会发生回溶、 澄明度不好、生物物质失活、含量不 均匀或偏低、复溶不溶性微粒不合格等。复溶不溶性微粒不合格有丁基胶塞有静电吸附作用，活洗未能活洗表面颗 粒；或压塞产生微粒等，要选择光滑的胶塞，减轻静电吸附作用。七冻十制剂的冻十周期缩短有调查中提到目前国内冻十制剂的冻十周期较长，影响产品的产量和经济效 益。国产冻十机的运行，一般每1小时约需水58吨，用电功率约2025kw,