CreloxPCRISPRCas技术与病毒载体在基因敲除中的联用

1、1会计学CreloxPCRISPRCas技术与病毒载体在技术与病毒载体在基因敲除中的联用基因敲除中的联用Cre蛋白于蛋白于1981年从年从P1噬菌体中被发现，属于噬菌体中被发现，属于Int酶超基因家族。酶超基因家族。 p Cre重组酶基因编码区序列全长重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码编码343个个氨基酸氨基酸, 38kDa, 单体单体蛋白蛋白。p Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两能特异地在两个个loxP位点位点间发生基因重组间发生基因重组。p Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的重组酶无需借助任何

2、辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、底物，如线形、环状甚至超螺旋环状甚至超螺旋DNA。loxP位点，是位点，是locus of X-over P1的缩写的缩写，来自，来自P1噬菌体。间隔噬菌体。间隔序列决定序列决定loxP的的方向，如下方向，如下所示所示：13bp 8bp 13bpATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTATCyclization recombinase启动子启动子靶组织或细胞靶组织或细胞albumin肝脏肝脏insulin胰岛胰岛b b细胞细胞adipose protein 2脂肪细胞脂肪细胞b b-lactoglobin乳腺乳腺ker

3、atin 5皮肤皮肤muscle creatine kinase骨骼肌骨骼肌myosin心脏心脏protamine-1精子精子CD19B淋巴细胞淋巴细胞proximal lckT淋巴细胞淋巴细胞Wnt-1 or engrailed-2神经系统神经系统启动子启动子诱导物诱导物Cre表达的靶组织表达的靶组织Mx1IFN肝脏、免疫细胞肝脏、免疫细胞CMV-tTAtetracycline广泛表达广泛表达CMV-ERtamoxifen广泛表达广泛表达MerCreMer重组蛋白重组蛋白非同源末端连接（非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）p均由自然界存在的核酸酶

4、系统改造而来均由自然界存在的核酸酶系统改造而来p均具有识别核酸碱基特异性的结构域均具有识别核酸碱基特异性的结构域p作用机制：作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口，均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰N代表任意代表任意DNA碱基碱基pGuide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating crRNA ）结合形成）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工复合物。通过人工设计这两种设计这两种 RNA，

5、可以改造形成具，可以改造形成具有引导作用的有引导作用的sgRNA （short guide RNA ）pCas9:复合物引导核酸酶复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分结构域剪切配对的部分，Ruvc结构域剪切未配对的链结构域剪切未配对的链。1. 靶基因分析靶基因分析：明确CDS外显子部分；2. sgRNA位点设计：位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子

6、ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5和3侧翼序列。3. Cas9载体构建：载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定；4. Cas9载体活性检测载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，进行重组效率的检测。的功能。BCre-dependent Cas9 mice思考题思考题p均由自然界存在的核酸酶系统改造而来均由自然界存在的核酸酶系统改造而来p均具有识别核酸碱基特异性的结构域均具有识别核酸碱基特异性的结构域p作用机制：作用机制