利用木糖发酵高产酒精菌株的诱变育种和驯化研究

1、    利用木糖发酵高产酒精菌株的诱变育种和驯化研究    赖颖郭翠等赖颖 闵伟红 张大力 吉林农业大学食品科学与工程学院 130118摘要:本文以热带假丝酵母作为出发菌株,进行了紫外诱变和驯化,利用木糖生产燃料酒精,以获得高产菌株。通过实验得出:紫外诱变时最佳的菌液稀释倍数为10-4,最佳紫外照射时间为35s,通过三轮的紫外诱变育种进行筛选,获得酒精产量较高的菌株,其中突变株y27,酒精产率达到了6.78%,木糖利用率为71.1%。对突变株27进行了驯化,驯化后的菌株,酒精产率提高到9.6%,木糖利用率达到了90.3%。关键词:热带假丝酵母;诱变;木糖

2、在全球环境恶化和能源危机日益严峻的今天,燃料乙醇作为一种可利用的绿色能源正逐渐成为各国能源发展的战略方向。采用传统的以玉米、小麦等粮食为原料的发酵方法对粮食的需求量很大和成本高的缺点逐渐显现出来,己不能满足市场的需要。尤其我国是个人口大国,粮食安全是关系到人民生活和社会稳定的重大问题。所以我国在“十一五”计划中大力提倡用非粮原料生产燃料乙醇1。我国以农作物秸秆为代表的木质纤维素类生物质资源十分丰富,年产量高达6亿多吨,大部分未能被有效利用,造成资源严重浪费。木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素混合在一起的材料。在植物纤维素中,纤维素、半纤维素占木质纤维素质量的70%,纤维素和半纤维素

3、必须经过水解分别形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,发酵生产乙醇。天然半纤维素水解产物的85-90%是木糖。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇,能使木质纤维素原料的乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25%。因此,实现木糖发酵生产乙醇是决定植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键因素。木糖过去一直被认为不能被微生物发酵成乙醇,karczewska2第一次提出用木糖发酵乙醇,但这个发现未引起足够重视,直到1980年,wang等人提出木糖可被一些微生物发酵成乙醇。迄今为止已经发现有一百多种微生物能够利用木糖,其中酵母菌的发酵能力是最强的,也利于工业生产应用。本文以中科院微生物所购买的热带假丝酵母为出发

4、菌株,进行了诱变和驯化,该菌显现出良好的改造及应用前景。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种热带假丝酵母(g.tropicalis)购自中国微生物菌种保藏管理中心1.1.2培养基木糖固体培养基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l,琼脂20g/l。木糖液体培养基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。酵母木糖发酵培养基:木糖50g/l,kh2po42g/l,酵母粉1g/l,mgpo41g/l。酵母木糖驯化培养基:木糖20 g/l-70g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。1.1.3试剂和仪器灭菌器,空气摇床,超净工作台,旋转蒸发器,2100分光光度计,试

5、管、平皿,三角瓶,比色皿、酵母浸粉,蛋白胨,木糖,琼脂粉,试剂a(0.32085g高碘酸钠溶于100ml的1%稀盐酸溶液中),试剂b(1.11g/l的鼠李糖溶液),nash试剂(现配现用,150g/l乙酸钠100ml溶液中加入0.2ml乙酸和0.2ml乙酰丙酮)等。1.2试验方法1.2.1乙醇含量测定的标准曲线重铬酸钾比色法3吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中,稀释至刻度,混匀。分别吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50 ml容量瓶中,各加15.0 ml重铬酸钾溶液,加水至刻度,混匀。此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00

6、、7.00(v/v)的酒精。以空白标准作参比,在波长600nm,用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。用吸光度对酒精浓度作图,绘标准曲线。1.2.2 木糖含量的测定将1mg/ml的标准木糖母液用去离子水按不同比例稀释成含糖量为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml的标准木糖液。取有刻度试管,加入1ml标准糖液+1mldns混匀于沸水浴5min后,冷却,用蒸馏水补充至10ml,于490nm处测吸光值。1.2.3生长曲线的测定(1)挑取一环4下保存的菌落于200mlyepd液体培养基中,在30和l00r/min的条件下培养18-24h进行活化培养,即得液体种子。(

7、2)配制yepd液体培养基3200ml,分装于三角瓶中,每个三角瓶中准确加入100ml。于115下高压蒸汽灭菌30min。(3)将活化好的液体种子接种于每个三角瓶中,接种量为6%。(4)将三角瓶在100r/min的摇床中30下培养。每间隔2h取一次样,测其600nm处的吸光值。由图3可知,1号菌株在2h之后进入对数生长期,在48h的时候od值达到最大,然后进入平稳期。1.2.4紫外诱变方法4挑取一环对数期的原菌于9ml的蒸馏水中,振荡均匀后吸取1ml的菌悬液于9ml的蒸馏水中,这样依次稀释至10-7的浓度,依次吸取10-110-7菌浓度的菌悬液100µl于50个装有完全培养基凝固平板

8、中,每个稀释度各10个平板,均匀涂布,取两组10-110-5稀释度平板作对照,后八组分别于紫外线下诱变20s,30s,35s,40s。将诱变后的平板和对照平板在无光条件下30培养2d,观察并查菌落数。经过试验结果得出致死率最佳稀释度和紫外诱变时间。1.2.5木糖发酵菌的驯化为稳定和提高筛选酵母利用木糖发酵酒精的能力,将筛选菌株接入酵母木糖驯化培养基驯化5培养数代,并逐步提高发酵液中的初始木糖含量,根据秸秆水解液中木糖含量,将木糖含量的上限控制在7%,直至菌体适应木糖含量上限. 将驯化后的菌株接种发酵,测定其酒精浓度、残糖浓度、ph等参数,研究其发酵性能。用灭菌后的接种环挑取2环酵母菌接种至木糖

9、浓度为20g/l的100mlyepd液体培养基中,30摇床90r/min连续培养96h,其后以6%的接种量将菌液接入木糖浓度为30g/l的液体培养基中,30摇床90 r/min再次连续培养96h,以此类推直至在木糖浓度为70g/l 的液体培养基中培养完毕完成菌株的定向驯化。2. 结果与分析2.1 紫外线最佳照射剂量的选择紫外线照射时间对热带假丝酵母致死率的影响见表1。紫外线照射对热带假丝酵母有明显的致死效应,致死率随照射剂量增大而增大。由表2可以看出,出发菌株对紫外线照射的耐受能力较强,菌浓度分别为103 ,104,105时,在35s时 的处理条件下,其致死率为80.06 %85.91%. 为

10、保证有较高的筛选机率,选择35s作为紫外线照射剂量。2.2 紫外线照射后突变株的选择菌种经过3 次诱变后从其中挑选菌落直径较大者38株,接入斜面,从中选出8 株产酒精能力明显高于其它突变株,其产酒精能力见表2。由表2可以看出,经过传代试验,只有y11、y27 能稳定产酶且酶活力较高,其中y27 产酒精能力最高为6.78%。2.3驯化菌种为稳定酵母利用木糖的能力,将菌株接入酵母木糖驯化培养基驯化培养数代,并逐步提高发酵液中的初始木糖含量,驯化后菌体逐渐适应了木糖发酵液环境,对代谢过程中的有害物质的抵抗力逐渐增强,木糖的利用率显著提高,酒精产量提高,见表3。3. 结论本试验以购买的热带假丝酵母菌株

11、为诱变出发菌株,经过紫外线诱变及驯化筛选后,得到1株稳定的产酒精生产菌株。热带假丝酵母的诱变育种最佳条件为紫外线照射时间35s ,菌浓度104,酒精产率由出发菌3.28% 提高到6.78%,木糖利用率由45.3%提高到71.1%,驯化之后突变株y27的酒精产率提高到9.6%,木糖利用率达到了90.3%。但是该菌株酒精产率还达不到工业化生产水平,应继续采用基因工程育种方法提高其产酒精水平,使之能应用于工业生产。参考文献:1 kerstinskoogandbarbelhalin一hagerdal.enzymemierob.teehnol.1988;10(2):66.2preez d j c. process parameters and environmental.facters affecting d - xylose fermentation by yeasts j .enzymemicrob technol, 1994, 16 (8) : 943 - 955. 3沈怡方,白酒生产技术全书(第一版)m北京:中国轻工业出版社,1998,654-655.4王莘.紫外线的诱变育种.发酵工艺原理实验技术 2004,10.5skoog k,et al.enzyme microb.technol.1988,10(2);66-88.作者简介: 赖颖,周口师范学院教师,助教 女 1981年8