高级生物化学.PPT

1、12l核酸专题（李正文）核酸专题（李正文）l蛋白质专题（何冰）蛋白质专题（何冰）l代谢调控专题（韦海华）代谢调控专题（韦海华）3l核酸的结构核酸的结构l核酸的性质与研究方法核酸的性质与研究方法l核酸研究的新进展核酸研究的新进展4l王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学王琳芳，蛋白质与核酸，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，联合出版社， 1998 1998l韦弗，分子生物学，科学出版社韦弗，分子生物学，科学出版社, ,麦格劳麦格劳- -希尔国际公司希尔国际公司 ，20002000l郜金荣郜金荣 ，分子生物学，武汉大学出版社，分子生物学，武汉大学出版社，19991999l阎隆

2、飞阎隆飞 ，分子生物学，分子生物学， 北京农业大学出版社北京农业大学出版社 ，19971997lDienbach,C.W. PCR Dienbach,C.W. PCR 技术实验指南，科学出版社，技术实验指南，科学出版社， 1998 1998l苏慧慈，苏慧慈， 原位原位 PCRPCR，科学出版社，科学出版社，1995199556(primary structure of n)7l脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存）：存在于细胞核和线粒体内，是贮存和携带遗传信息的物质。和携带遗传信息的物质。l核糖核酸（核糖核酸（ribo

3、nucleic acid，RNA）：存在）：存在于胞浆中，参与遗传信息的表达。于胞浆中，参与遗传信息的表达。8mRNA ，信使核糖核酸，信使核糖核酸tRNA，转运核糖核酸，转运核糖核酸rRNA，核糖体核糖核酸，核糖体核糖核酸其中其中 RNA 又分为三类：又分为三类：9脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）人人60 10-9 mg牛牛65 10-9 mg 鼠鼠 66 10-9 mg 鸡鸡26 10-9 mg 鸭鸭 21 10-9 mg 蟾蜍蟾蜍 73 10-9 mg 鲤鱼鲤鱼 33 10-9 mg几种不同生物的细胞内几种不同生物的细胞内 DNA的含量的含量10五碳五碳 糖糖磷酸磷酸碱基碱基核苷核苷

4、核苷酸核苷酸核糖核糖核糖核苷酸核糖核苷酸脱氧脱氧 核糖核糖脱氧核苷酸脱氧核苷酸核酸的基本单位核苷酸11腺嘌呤脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA的基本单位腺嘌腺嘌呤呤碱基碱基脱氧脱氧 核糖核糖磷酸磷酸A G C T鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌鸟嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶胸腺胸腺嘧啶嘧啶12核糖核苷酸RNA的基本单位腺嘌腺嘌呤呤胞嘧胞嘧啶啶碱基碱基核糖核糖磷酸磷酸鸟嘌鸟嘌呤呤A G C U尿嘧尿嘧啶啶鸟嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸13l核酸的一级结构核酸的一级结构：是指核酸中核苷酸的排列：是指核酸中核苷酸的排列顺序。是其高级结构和功能的基础。顺序。是其高

5、级结构和功能的基础。核苷酸之间通过核苷酸之间通过3 3 ,5 ,5 - -磷酸二酯键磷酸二酯键连接连接14（一）（一） 限制性内切酶限制性内切酶(Restriction endonuclease ) 1 定义：在原核生物中存在的能识别外源定义：在原核生物中存在的能识别外源DNA双链中双链中46个碱基对组成的特异序列，并个碱基对组成的特异序列，并在此序列某位点水解外源在此序列某位点水解外源DNA，这类酶称，这类酶称限制限制性内切酶。性内切酶。 作用的位点称作用的位点称靶位点。靶位点。核酸的一级结构15限制性内切酶l限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数来限制性内切酶主要存在于原核生物中，大多数

6、来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制细菌的限制-修饰体系，限制外源修饰体系，限制外源DNA、保护内源、保护内源DNA。l1970年年Smith等分离到第一种限制性核酸内切酶，等分离到第一种限制性核酸内切酶，为为DNA分子体外剪切奠定了技术基础。分子体外剪切奠定了技术基础。16 限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶的命名：一般是以微生物属名的第一般是以微生物属名的第一个字母一个字母（大写）（大写）和种名的前两个字母组成，第四个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株表示菌株(品系品系)。字母后面的罗马字则是简单地表明该种生。字

7、母后面的罗马字则是简单地表明该种生物中不同限制酶分离的先后顺序。例如，分离自产色链霉物中不同限制酶分离的先后顺序。例如，分离自产色链霉菌菌(Streptomyces achromogenes )的两种限制酶被分别命名为的两种限制酶被分别命名为SacI和SacII。比如限制酶比如限制酶Hinc和和Hind则是分别来自流则是分别来自流感嗜血菌感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的的c和和d血清型菌株。血清型菌株。2 限制性核酸内切酶的命名和种类限制性核酸内切酶的命名和种类 迄今为止，已有上千种限制酶被分离纯化，从目前已迄今为止，已有上千种限制酶被分离纯化，从目前已商品化的商品化

8、的100多种限制酶的识别序列可以看出，限制酶所识多种限制酶的识别序列可以看出，限制酶所识别的别的DNA序列大多数都富含序列大多数都富含胞嘧啶胞嘧啶(C)和鸟嘌呤和鸟嘌呤(G)。限制性内切酶17限制性内切酶限制性核酸内切酶的种类：限制性核酸内切酶的种类：l最早从大肠杆菌中发现的最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于就属于I类酶。类酶。其分子量较大；反应过程中除需其分子量较大；反应过程中除需Mg2+外，还需要外，还需要S-腺苷腺苷-L甲硫氨酸、甲硫氨酸、ATP；在；在DNA分子上没有特异性分子上没有特异性的酶解片断的酶解片断.lI型限制性内切酶能识别型限制性内切酶能识别DNA分子内非甲基化

9、的分子内非甲基化的特定序列，但切割是随机的，且切割位点远离识别特定序列，但切割是随机的，且切割位点远离识别位点，不能生成特定片段，因此，位点，不能生成特定片段，因此，I类酶作为类酶作为DNA的分析工具价值不大的分析工具价值不大。18限制性内切酶lII类酶有类酶有EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III等。等。其分子量小于其分子量小于105道尔顿；反应只需道尔顿；反应只需Mg2+；最重要；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而因而DNA分子经过分子经过II类酶作用后，可产生特异性的类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，

10、这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。酶切后可形成粘性末端或平整末端别。酶切后可形成粘性末端或平整末端。lII型限制性内切酶能识别型限制性内切酶能识别DNA分子中的特定序分子中的特定序列，大部分具有回文结构。列，大部分具有回文结构。 IIII型限制性内切酶型限制性内切酶识别的识别的DNADNA序列一般长度是序列一般长度是4 4、5 5和和6 6个碱基对。个碱基对。193 限制性内切酶的识别序列与酶切特点限制性内切酶的识别序列与酶切特点 (1)限制酶识别的限制酶识别的DNA特异序列具有回纹结构特异序列具有回纹结构的序列。的序列。 (2)限制酶识别序列限

11、制酶识别序列4-6个碱基对。个碱基对。 现在已从各种微生物中发现上千种限制酶，现在已从各种微生物中发现上千种限制酶，它们识别序列的长度最短的是它们识别序列的长度最短的是4个核苷酸，最长个核苷酸，最长的为的为8个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高个核苷酸。基因克隆过程中使用频率最高的是识别的是识别6个碱基对的限制酶。个碱基对的限制酶。 限制性内切酶20EcoR I的识别位点的识别位点G A A T T C53C T T A A G35A A T T CG5-粘性末端粘性末端Hind III的识别位点的识别位点T T C G A AA A G C T T 5335A G C T TA5-粘性末端粘

12、性末端限制性内切酶21Hae III的识别位点的识别位点Pst I的识别位点的识别位点G G C C53C C G G35C T G C A G53G A C G T C35 G G C C C C G G平整末端平整末端C T G C AG3-粘性末端粘性末端限制性内切酶22在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序在已发现的限制性内切酶中，近百种酶的识别顺序已被确定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，已被确定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序，这种酶称为这种酶称为“异源同功酶异源同功酶”(isochizomer)。应该注意的是。应该注意的是，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们

13、的，这些酶虽然有相同的识别顺序，但它们的切点并不完全切点并不完全一样。一样。例如例如Xma I和和Sma I都识别六核苷酸都识别六核苷酸CCCGGG，但，但Xma I的切点在的切点在cCCGGG，而，而Ema I的切点则在的切点则在CCCGgGG，前者切割，前者切割DNA分子，形成带有分子，形成带有CCGG粘性粘性末端的末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端。片段，而后者并不形成粘性末端。 当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如当然，也有识别顺序和切点都相同的酶，如Hap II、Hpa II、Mno I，都在识别顺序，都在识别顺序CCGG内有一相同的切点内有一相同的切点，Hal III和和B

14、suR I同样在识别顺序同样在识别顺序GGCC内有一相同的切内有一相同的切点。点。限制性内切酶23 用限制性内切酶把用限制性内切酶把DNA切割成一定大小切割成一定大小的片断，这些酶解片断的排列顺序就叫的片断，这些酶解片断的排列顺序就叫DNA的限制酶图谱。的限制酶图谱。 图谱制作简单，将纯化的图谱制作简单，将纯化的DNA用不同的用不同的限制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确限制性内切酶切割，进行凝胶电泳分析，确立了立了DNA限制酶图谱后，就可以测定每个限制酶图谱后，就可以测定每个DNA片断的碱基顺序，最后排列出完整的片断的碱基顺序，最后排列出完整的DNA分子碱基顺序。分子碱基顺序。(二）二）DN

15、A的限制酶图谱的限制酶图谱核酸的一级结构24DNA序列测定技术从序列测定技术从60年年代最早提出设想至今，已代最早提出设想至今，已经日臻完善，测定序列的经日臻完善，测定序列的技术也越来越简化，在各技术也越来越简化，在各项研究工作中的地位也日项研究工作中的地位也日趋重要。趋重要。 核酸的一级结构25DNA序列测定l对于较小片断（500bp)的DNA,可直接利用质粒系统（如PUC18，PUC19等）测序。26DNA序列测定对于大片段对于大片段DNA，可采用：，可采用：l限制性片断亚克隆法限制性片断亚克隆法 对对DNA进行酶切分析，确定酶谱后，以合适的限制性内切酶进行酶切分析，确定酶谱后，以合适的限

16、制性内切酶降解以制备各种长度的限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建降解以制备各种长度的限制酶片断，并亚克隆到测序载体上建立亚克隆库，然后测亚克隆立亚克隆库，然后测亚克隆DNA序列，通过排列分析，确定序列，通过排列分析，确定DNA片断的全序列片断的全序列l随机法（鸟枪测序法）随机法（鸟枪测序法） 利用一定的方法将目的利用一定的方法将目的DNA随机打断成大小不同的片断随机打断成大小不同的片断并获得亚克隆，收集这些亚克隆的并获得亚克隆，收集这些亚克隆的DNA资料，通过计算机处理资料，通过计算机处理而获得目的而获得目的DNA的全部序列。的全部序列。27DNA序列测定l传统的序列测定技术有两种，传统的序列

17、测定技术有两种，Sanger 等等(1977)提出的酶法及提出的酶法及Maxam和和Gibert(1977)提提出的化学降解法。出的化学降解法。 28lSanger双脱氧链终止法使用特异引物双脱氧链终止法使用特异引物 在在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，在聚合酶作用下进行延伸反应，在DNA合成反应合成反应混合物的混合物的4种普通种普通dNTP中，加入少量的一种双中，加入少量的一种双脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，由于作为链终止剂，由于ddNTP在脱氧核糖的在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，不位置缺少一个羟基，不能与后续的能与后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使形成磷酸二酯

18、键，从而使DNA链中断。链中断。 DNA序列测定2930l反应产物是一系列的核苷酸链，它们将分别反应产物是一系列的核苷酸链，它们将分别终止模板链的每一个终止模板链的每一个A，每一个，每一个C，每一个，每一个G或每一个或每一个T的位置上。的位置上。 31DNA序列测定3233l化学降解法原理是用某些专用的化学试剂修饰各种化学降解法原理是用某些专用的化学试剂修饰各种碱基，使相应的糖苷键变得不稳定，在哌啶的作用下，碱基，使相应的糖苷键变得不稳定，在哌啶的作用下，糖苷键断裂，从而得到以特定碱基结尾的一系列糖苷键断裂，从而得到以特定碱基结尾的一系列DNA片段，经电泳分离，推断出碱基的序列。片段，经电泳分

19、离，推断出碱基的序列。DNA序列测定34经过大量的筛选，发现以下几种试剂与哌啶一起经过大量的筛选，发现以下几种试剂与哌啶一起作用，可以在特定的碱基部位断键：作用，可以在特定的碱基部位断键：1 硫酸二甲酯哌啶硫酸二甲酯哌啶 在在G处断键处断键2 HCl+哌啶哌啶 在在A和和G处断键处断键3 水合肼哌啶水合肼哌啶 在在C和和T处断键处断键4 水合肼水合肼2MNaCl+哌啶哌啶 在在C处断键处断键35化学裂解法测定化学裂解法测定DNA序列示意图序列示意图 36DNA序列测定l近年来随着近年来随着PCR技术和技术和M13噬菌体及噬菌噬菌体及噬菌体载体的发展，也由于现成的合成引物唾手体载体的发展，也由于

20、现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法得到广泛应用，市场上多数厂家生产的测序得到广泛应用，市场上多数厂家生产的测序试剂盒，测序仪器均按此原理设计，试剂盒，测序仪器均按此原理设计， 37DNA序列测定l标记物的种类也日益增多，除了放射性标标记物的种类也日益增多，除了放射性标记外，还有多种荧光标记，除了标记在特记外，还有多种荧光标记，除了标记在特异的引物上，还可标记在异的引物上，还可标记在ddNTP上，还可上，还可同时将四种不同的荧光分别标记在同时将四种不同的荧光分别标记在A，C，G，T上，在一个反应中完成测序，各种核上，在一个反应中完成测序

21、，各种核酸混合物在通过荧光检测系统时，可根据酸混合物在通过荧光检测系统时，可根据四种不同的荧光一次性将测序阅读完毕。四种不同的荧光一次性将测序阅读完毕。 38l一、材料：一、材料：l1、测序、测序DNA聚合酶聚合酶 33U/ll2、酶稀释缓冲液、酶稀释缓冲液l3、反应缓冲液、反应缓冲液39l4、 ddATP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddATP 3MlddCTP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddCTP 3MlddGTP混合物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddGTP 3MlddTTP混合

22、物：混合物：dATP,dCTP,dGTP,dTTP各各150M，ddTTP 3M质粒测序方法40l5、甲酰胺上样缓冲液、甲酰胺上样缓冲液l6、标记引物、标记引物 2pmol/ll7、1.5ml薄壁离心管薄壁离心管l8、PCR自动热循环仪自动热循环仪质粒测序方法411、取、取4个个0.2l薄壁管，分别标记薄壁管，分别标记A，C，G，T，置于冰上。，置于冰上。质粒测序方法2、分别加入、分别加入3lddATP混合物，混合物，ddCTP混合混合物，物，ddGTP混合物，混合物，ddTTP混合物至标好混合物至标好的的A，C，G ，T管内，盖好盖子，以防蒸管内，盖好盖子，以防蒸发。发。423、用酶稀释液稀

23、释测序、用酶稀释液稀释测序DNA聚合酶：聚合酶：4个反个反应需用应需用7l稀释缓冲液加稀释缓冲液加3l测序测序DNA聚合酶，聚合酶，从而得到从而得到10l浓度为浓度为10U/l的测序的测序DNA聚合酶。聚合酶。质粒测序方法434、配制反应混合液：、配制反应混合液：反应缓冲液反应缓冲液 3l2pmol/l标记引物标记引物 1l待测质粒待测质粒DNA0.2g/l 1l水水 14l稀释好的酶稀释好的酶 2l总体积总体积 20l质粒测序方法445、混匀后在标好的、混匀后在标好的A，C，G，T管内分别加入管内分别加入5l反应混合液，混匀加反应混合液，混匀加1020l石蜡油。石蜡油。6、进行、进行PCR循

24、环：循环：注意：退火温度主要依赖于引物的特异序列，以注意：退火温度主要依赖于引物的特异序列，以及模板纯度，下面仅介绍一般程序：及模板纯度，下面仅介绍一般程序：95 预变性预变性1分钟分钟50 30”70 60”95 30”共共30个循环。个循环。质粒测序方法457、加、加8l甲酰胺上样缓冲液，混匀甲酰胺上样缓冲液，混匀8、取、取2l电泳电泳9、如果是荧光标记，可由测序仪自动分析、如果是荧光标记，可由测序仪自动分析测序结果；如果标记物为放射性，则凝胶测序结果；如果标记物为放射性，则凝胶电泳结束后用胶片放射自显影，然后以胶电泳结束后用胶片放射自显影，然后以胶片上读结果。片上读结果。质粒测序方法46

25、质粒测序方法4748SequenceAnalyzer质粒测序方法49一、一、DNADNA的二级结构的二级结构（1 1）二级结构的含义）二级结构的含义: : DNA的二级结构是指的二级结构是指DNA的双螺旋结构。的双螺旋结构。 绝大多数绝大多数DNA是由两条多脱氧核苷酸链构是由两条多脱氧核苷酸链构成的双链分子或双链环状分子，只有少数病毒成的双链分子或双链环状分子，只有少数病毒为为DNA单链环状分子（如单链环状分子（如M13,X174)50（2 2）DNADNA碱基组成的特点碱基组成的特点ChargaffChargaff定律定律 碱基当量定律碱基当量定律 A+G=T+CA+G=T+C 不对称比率不

26、对称比率 A+T/G+CA+T/G+C（3 3）二级结构的典型结构）二级结构的典型结构 B-DNA(Watson & CrickB-DNA(Watson & Crick模型模型,1953,1953年）年）DNA的二级结构51DNA的二级结构52DNA的二级结构53DNA的二级结构54DNA的双螺旋结构的双螺旋结构DNA的二级结构55 右手螺旋，有大沟和小沟右手螺旋，有大沟和小沟 2. 直径直径20，10个碱基组成一个螺旋，个碱基组成一个螺旋，沿中心轴上升沿中心轴上升3.4 3. 磷酸和戊糖组成的链位于外侧，碱磷酸和戊糖组成的链位于外侧，碱基位于内侧基位于内侧 4. A和和T配对

27、，配对，G和和C配对配对 5.维持双螺旋结构的主要力：氢键和碱维持双螺旋结构的主要力：氢键和碱基堆积力基堆积力DNA的二级结构56类型类型 旋转旋转方向方向 螺旋螺旋直径直径nm 螺距螺距nm 每转碱每转碱基对数基对数目目 碱基对垂碱基对垂直距离直距离nm 碱基对碱基对与水平与水平面倾角面倾角 A-DNA右右 2.3 2.8110.25520B-DNA右右 2.03.4100.3400C-DNA右右 3.19.30.3106Z-DNA左左1.84.5120.370-9DNA的二级结构57DNA的二级结构58DNA的二级结构59回文结构镜像重复三股螺旋（H-DNA）DNA的其它结构60DNA的其

28、它结构61AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG 存在于同一股上的某些DNA区段的反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。DNA的其它结构62DNADNA三股螺旋（三股螺旋（H-DNA,ts-DNAH-DNA,ts-DNA）DNA的其它结构63646566双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。是双螺旋进一步扭曲形成的超螺旋。是一种比双螺旋更高层次的空间构象。一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：包括：线状线状DNADNA形成的纽结、超螺旋形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状和

29、多重螺旋、环状DNADNA形成的结、超形成的结、超螺旋和连环等螺旋和连环等67DNA的三级结构68DNA的三级结构69 RNA的一级结构是由数量极其庞大的四种的一级结构是由数量极其庞大的四种核糖核酸（核糖核酸（AMP、GMP、CMP、UMP）按）按一定顺序，通过一定顺序，通过3 ，5 磷酸二酯键连成的线磷酸二酯键连成的线形分子。形分子。 RNA的二级结构是短的，不完全螺旋的多的二级结构是短的，不完全螺旋的多核苷酸链。核苷酸链。 RNA的三级结构是在茎环结构基础上进一的三级结构是在茎环结构基础上进一步扭曲折叠而成的复杂结构。步扭曲折叠而成的复杂结构。70tRNA的一级结构的一级结构 由由7493

30、个（多为个（多为76个）核苷酸组成单链个）核苷酸组成单链 ； 具有不变的（恒定的）核苷酸具有不变的（恒定的）核苷酸:U8 、G18 、 G19 ； 含较多的修饰核苷酸；含较多的修饰核苷酸； 5端多为端多为PG , 3端多为端多为CCAOH 。2.tRNA的二级结构的二级结构三叶草结构三叶草结构 具有四臂四环，具有四臂四环， 3端为端为CCAOH 序列序列 ， 5端为端为PG 3. tRNA的三级结构的三级结构倒倒L形结构形结构RNA的结构71RNA的结构72RNA的结构73RNA的结构74 rRNA是核糖体的组成成分,其种类和大小用S表示。 30S 16S原核生物 70S 23S 50S 5S

31、 40S 18S真核生物 80S 28S 60S 5.8S 5SRNA的结构75RNA的结构7677一一. .一般理化性质一般理化性质1.晶形晶形DNA为白色纤维状固体；为白色纤维状固体；RNA为白色粉末状固体为白色粉末状固体2.溶解性溶解性均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中乙醇中形成沉淀；形成沉淀； 在在0.14MNaCl 和和 12MNaCl中中 DNA-蛋白蛋白 溶解度低溶解度低 溶解度高溶解度高 RNA-蛋白蛋白 溶解度高溶解度高 溶解度低溶解度低3.粘度粘度 DNA粘度很大粘度很大 RNA粘度小得多粘度小得多4.旋光性旋光性 均很强均很强5密

32、度及沉降性密度及沉降性密度：密度：RNA双链双链DNA；环状；环状DNA 开环、线状开环、线状DNA78纯纯DNA OD260/OD280=1.8纯纯RNA OD260/OD280=2.0 嘌呤碱和嘧啶碱具有嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使共轭双键，使DNA和和RNA在在240290nm处有处有强烈紫外吸收，最大吸收强烈紫外吸收，最大吸收260nm核酸的性质79密度：密度： RNA双链双链DNA； 环状环状DNA 开环、线状开环、线状DNA 单链单链DNA 双链双链DNA 沉降速度：沉降速度： RNA 环状环状DNA 开环、线状开环、线状DNA核酸的性质80四.核酸的变性、复性变性：指双螺旋区氢

33、键断裂变成单链，不涉及一级结构破坏的过程。复性：变性DNA在适当条件下，又可使两条分开的链重新缔合成双螺旋的过程。核酸的性质81核酸的性质82一、核酸电泳一、核酸电泳最常用：凝胶电泳最常用：凝胶电泳优点：简单，快速，灵敏，成本低。优点：简单，快速，灵敏，成本低。常用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳常用有：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳83 常用于分析常用于分析DNA，用于分析，用于分析RNA时，由时，由于其常含有于其常含有RNA酶，必须先加蛋白质变性剂酶，必须先加蛋白质变性剂（如甲醛等）处理后才能用于分析（如甲醛等）处理后才能用于分析核酸的研究方法841 核酸分子大小：与分子量大小对

34、数成反比。核酸分子大小：与分子量大小对数成反比。2 胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，常用胶浓度：迁移率与胶浓度成反比，常用1凝胶。凝胶。3 DNA构象：超螺旋最快，线形构象：超螺旋最快，线形DNA其次，开环形最其次，开环形最慢。慢。4 电流：一般不大于电流：一般不大于5v/cm。5 碱基组成：有影响，但不大。碱基组成：有影响，但不大。6 温度：温度：430，常在室温下进行，常在室温下进行核酸的研究方法85 电泳完毕，将凝胶在溴乙锭溶液中染色电泳完毕，将凝胶在溴乙锭溶液中染色（0.5ug/ml)。 溴乙锭为一扁平分子，很容易插入溴乙锭为一扁平分子，很容易插入DNA碱基碱基对之间。对之间。 DNA与

35、溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发与溴乙锭结合后，经紫外光照射，可发射出红橙色的可见荧光。射出红橙色的可见荧光。0.1ugDNA即可检出。即可检出。核酸的研究方法86加入交连剂加入交连剂其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于其孔径比琼脂糖小，所以用于分子小于1000bp的的DNA片断。另外，一般不含片断。另外，一般不含RNA酶，所以可以酶，所以可以用于用于RNA分析。分析。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品，经溴乙锭染色聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品，经溴乙锭染色后，在紫外光下，发出的荧光很弱，所以，浓度后，在紫外光下，发出的荧光很弱，所以，浓度很低的样品不能用此法检测。很低的样品不能用此法检测。 核酸的研究方法

36、87核酸的研究方法88核酸的研究方法89核酸的研究方法90核酸的研究方法91 紫外照射下切下所需紫外照射下切下所需DNA,切下的胶条放于透析切下的胶条放于透析袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳，袋中，装上电泳缓冲液，在水平槽中进行电泳，34小时后，小时后，DNA将电泳出来并粘在透析袋内壁上将电泳出来并粘在透析袋内壁上，将电极倒转，通电，将电极倒转，通电3060秒，粘在内壁上的秒，粘在内壁上的DNA会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提会释放到缓冲溶液中，去胶条，用苯酚抽提12次，水相用乙醇沉淀次，水相用乙醇沉淀DNA。这样回收的。这样回收的DNA纯纯度很高度很高。核酸的研究方法9293聚

37、合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是是80年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。扩增技术。 它能在一个试管内将所要研究的目的它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍百万倍,使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星使肉眼能直接观察和判断。过去几天几星期才能做到的事情，用期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。里程碑。PCR技术9495llP

38、CR的最早设想：的最早设想： 本世纪本世纪60年代末、年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，技术，Korana于于1971年最早提出核酸体外年最早提出核酸体外扩增的设想：扩增的设想：“经过经过DNA变性，与合适的变性，与合适的引物杂交，用引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆断重复该过程便可克隆tRNA基因基因”。 PCR技术96lDNA的复制l核酸体外扩增的设想l聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链

39、酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术97lDNA的复制l核酸体外扩增的设想l聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术98lDNA的复制l核酸体外扩增的设想l聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAG

40、CGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术99lDNA的复制l核酸体外扩增的设想l聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA的变性与复性变性复性加热退火ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35PCR技术100PCR的实现：的实现： 19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公公司的司的MullisMullis等人发明了聚合酶链反应（等人发明了聚合酶链反应（PCRPCR）基本

41、原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，由于，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错易出错耐热耐热DNADNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCRPCR能高效率的能高效率的进行，随后进行，随后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化等因此项技术获诺贝尔化学奖学奖PCR技术101lPCR的改进与

42、完善：的改进与完善：Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合聚合酶是大肠杆菌酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的一个片段，其缺点是：的一个片段，其缺点是：此酶不耐高温，此酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要会变性失活，每次循环都要重新加。重新加。PCR技术102l其其PCR产物特异性较差，合成的产物特异性较差，合成的DNA片段不均片段不均一。一。 引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，此种酶催化的和引物之间的碱基错配，此种酶催化的PCR技术技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于虽较传统的基因扩增具备许多突出的优

43、点，但由于酶不耐热，在酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。技术在一段时间内没能引生物医学界的足够重视。PCR技术103l1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，其扩增的其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新片段

44、。但每循环一次，仍需加入新酶。酶。PCR技术104l1988年年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。为与聚合酶。为与大肠杆菌多聚酶大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使。此酶的发现使PCR广广泛的被应用。泛的被应用。 PCR技术105Taq DNA聚合酶的特点：聚合酶的特点：l耐高温，在耐高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原来的后其残留活性大于原

45、来的90%，在在93下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的60%，在，在95下反下反应应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的40%。l在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。酶。l大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。性也大大提高。PCR技术106lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNT

46、P混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/LPCR技术107lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点108lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点109110lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性DNADNA变性变性形成形成2 2条单链条单链子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍PCR技术11

47、1lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR技术112lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点95 50引物1引物2DNADNA引物引物PCR技术113lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR技术114lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR技术115lPCR反应条件lPCR过程lPC

48、R的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR技术116lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点72第2轮结束PCR技术117lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增PCR技术118理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR技术119lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点电泳分析PCR技术120lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点电泳分析121lPCR反应条件lPCR过程lPCR的特点灵敏度高灵敏度

49、高皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提等组织的粗提DN

50、ADNAPCR技术122仪器型号仪器型号生产厂家生产厂家型式型式特点特点管数管数报价报价1109型型 北京新北京新技术所技术所与军科院联合与军科院联合 变温水浴变温水浴 电子调温电子调温400.5ml 6400元元/台台 90A/B型型中科院遗传所中科院遗传所 机械臂变温水浴机械臂变温水浴电热电热14000元元/台台PTC-51A/B型型军事医学科学院军事医学科学院变温气流变温气流电子调兼作套式电子调兼作套式300.5ml12000元元/台台DNA Thermal CyclerPerkin ElmerCetus(美美)变温铝块变温铝块压缩机致冷压缩机致冷480.5mlUS $ 20000.-T

51、hermocycler 60 00 180B.BraunBiotech(德德)变温水浴变温水浴98四档四档电热电热,自来水冷却自来水冷却601.5ml1001.5ml1801.5mlDM 30000.Automatic temperature Cy-cler Single Block Twin BlockEricomp Inc.(美美)变温铝块变温铝块25100电热电热,自来水冷却自来水冷却291.5ml581.5mlUS $4985.-US $7980.-Grant AutogenGrant Instrumant Ltd(美美)变温水浴变温水浴099电热电热,自来水冷却自来水冷却或加冷循环器

52、或加冷循环器501.5ml or501.5ml US $3500Techne PHC-1PHC-2Techne Ltd.(英英)变温铝块变温铝块099三档三档电热电热500W水冷水冷100W540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -BioOvenBioThrm Corp(美美)变温气流变温气流-150115V 11A200s of 496plateUS $ 2990. -Trio-Thermo-block TB-1Biomertra(德德)半导体变温半导体变温220V320管管分别控温分别控温DM12900. -Micro cycler EEppendorf(美美)变

53、温铝块变温铝块220V/100V329管管US $ 3500. -国内外生产的几种国内外生产的几种DNA扩增仪扩增仪 1232400型型PCR扩增仪扩增仪2700型型PCR扩增仪扩增仪 9600型型PCR扩增仪扩增仪9700型型PCR扩增仪扩增仪124一一 、概、概 述述 （一）（一） PCR反应中的主要成份反应中的主要成份 1. 引物引物 ：引物的好坏往往是：引物的好坏往往是PCR成败的关成败的关键。键。 1252PCR反应系统的组成：反应系统的组成： 耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq酶）酶）模板模板DNA：即待分析的目的：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于，其长度不宜大于10kb。

54、引物：为了保证引物：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的链的3-端。端。 四种四种dNTP。 缓冲溶液：保证缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。值。 1261.引物设计遵循的原则：引物设计遵循的原则： (1) 引物长度约为引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。且难以合成。(

55、2) 引物中引物中G+C含量通常为含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在四种碱基应随机分布，在3端不存在连续端不存在连续3个个G或或C,因这样易导致错误引发。因这样易导致错误引发。(4) 引物引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少以减少由于密码子摆动产生的不配对。由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内在引物内, 尤其在尤其在3端应不存在二级结构。端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在两引

56、物之间尤其在3端不能互补端不能互补, 以防出现引物二聚体以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最减少产量。两引物间最好不存在好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物引物5端对扩增特异性影响不大端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在通常应在5端限制酶位点外再加端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的

57、序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增以免产生非特异性扩增,影响产量。影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子简并引物应选用简并程度低的密码子, 例例如选用只有一种密码子的如选用只有一种密码子的Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。见扩增产物。127 一般一般PCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产

58、量。过低则降低产量。利用紫外分光光度计利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度可精确计算引物浓度, 在在1cm光程比色杯光程比色杯中中,260nm下下,引物浓度可按下式计算：引物浓度可按下式计算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中引物中4种不同碱基个数。种不同碱基个数。 128 dNTP应用应用NaOH 将将pH调至调至7.0,并用分光光度计测定并用分光光度计测定其准确浓度其准确浓度.dNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/L并分装并分装,-20贮贮存。一般反应中每种

59、存。一般反应中每种dNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L。理论。理论上上4 种种 dNTP各各20mol/L,足以在足以在100l反应中合成反应中合成2.6g的的DNA。当。当dNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L时可抑制时可抑制Taq DNA聚聚合酶的活性合酶的活性.4种种dNTP的浓度应该相等的浓度应该相等,以减少合成中由于某以减少合成中由于某种种dNTP的不足出现的错误掺入。的不足出现的错误掺入。 129 Mg2+浓度对浓度对Taq DNA聚合酶影响很大聚合酶影响很大,它可影响酶的活性它可影响酶的活性和真实性和真实性,影响引物退火和解链温度影响引物退火和解链温度, 影响

60、产物的特异性以及引影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为浓度范围为0.5-2mmol/L.对于对于一种新的一种新的PCR反应反应,可以用可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的的递增浓度的Mg2+ 进进行预备实验行预备实验,选出最适的选出最适的Mg2+浓度。在浓度。在PCR反应混合物中反应混合物中, 应应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或例如磷酸基团或EDTA等可能影响等可能影响Mg2+离子浓度的物质离子浓度的物质,以保证最适以保证最适Mg2+浓度。浓度。3. Mg2+：1304. 模板：模板： PCR反应必须以反