等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中应用

1、等位基因特异性pcr在ace基因多态性检测中应用【摘要】目的：采用等位基因特异性pcr法对ace 基因多态性进行检测，并对脑血管疾病（cvd）与ace基因 多态性的相关性进行探讨。方法：将2010年2月-2013年2 月云南景颇族和傣族共73例cvd患者（cvd组）和43例健 康人员（对照组）进行ace基因多态性检测，并对结果进行 分析。结果：116例受检人员均获得扩增产物，cvd组患者 73例扩增产物中，dd型14例（19.2%）, ii型30例，id型 29例；对照组43例扩增产物中，dd型5例（11.6%）, ii型 19例，id型19例，对照组中dd型基因频率低于cvd组， 差异无统计

2、学意义（p>0.05）。结论：等位基因特异性pcr 检测技术可对ace基因多态性进行有效检测，对于cvd的防 治具有重要的参考意义。【关键词】等位基因特异性pcr；脑血管疾病；ace 基因多态性中图分类号r743文献标识码b文章编号1674-6805 （2013） 34-0042-02脑血管疾病 （cerebrovascular disease, cvd） 由脑血 管病变所引起，主要高发于65岁以上人群，患者发病后易 残留后遗症，导致劳动和生活能力丧失，也是人类死亡的重 要原因之一。cvd主要分为缺血性脑血管病和出血性脑血管 病，其中以缺血性为多见。cvd的产生由遗传因素和环境因 素共同

3、作用所引起，髙血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病 是cvd发生的首要高危因素1,而血管紧张素转换酶（ace） 基因多态性与高血压等心血管疾病的发生有关2。笔者选 择等位基因特异性pcr技术对云南景颇族和傣族73例cvd 患者的ace基因多态性进行检测，以期为ace基因多态性与 cvd的相关性提供临床依据，现将结果报道如下。1资料与方法1. 1 一般资料选取2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族46例 健康人员（对照组）和73例cvd患者（cvd组），取早晨空 腹静脉血10 ml,肝素抗凝后离心分离血浆，采用酚抽提法 抽提患者外周血白细胞dna模板,所有受检人员无血缘关系。1.2试剂与仪器

4、dna提取试剂选用天根dp-318 dna提取试剂盒；taq master等pcr反应试剂购自天根生化科技有限公司；引物由 捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，ace-f , 5 ' -ctggagaccactcccatcctttct-3 ', ace-r ,5'-gatgtggccatcacattcgtcagat-3' ； pcr 仪选用 icyclertm thermal cycler （美国bio-rad公司）；微量核酸蛋白定量 仪选用nd1000 uv/vis （美国nanodrop公司）；凝胶成像系 统选用 universal hoodll （美国 bi

5、o-rad 公司）。1. 3方法1.3. 1模板dna提取 在全血样品中加入prok 20 » 1, 完全混合、离心，再加入gb 200 ul,离心后加无水乙醇， 充分混合后过柱，弃滤液，加入tb 50 n 1,过柱后回收tb 定量，并对dna样品进行含量检测。1.3.2 pcr反应体系和反应条件扩增体系：ace-f或 ace-r 引物 1.5 hl, h20 7. 5 n 1 （样品），2xtaq-master 10 pl, dna 样品 1 ulo pcr 扩增条件：94 °cx4 min 预 变性，94 °cx30 s 变性，67 °cx30 s

6、退火，72 °cx30 s 延伸，共2831个循环，72 °cx4 min延伸后保存。采用 凝胶成像系统对扩增产物进行分析，所有样品的pcr实验以 及电泳分析均重复两次以上以对结果进行验证。1.4统计学处理采用spss 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资 料用均数土标准差（x土s）表示，比较采用t检验；计数资 料以率（）表示，等位基因频率差异采用字2检验，p0. 05）, 所有样品均经两次以上pcr及电泳验证，条带均清晰且结果 一致（图1）。dl 2000 490 bp （ii 型）190 bp （dd 型） （id 型）100 bp dna ladder图1 ac

7、e基因多态性等位基因特异性pcr检测结果3讨论脑血管疾病(cvd)是65岁以上人群的常见疾病，当患者脑部出现梗阻性缺血时即发生缺血性cvd,而当脑部血管 发生破裂时则为出血性cvd,患者易致残致死，丧失工作或 生活能力，危险性极高3。有研究表明，脑血管疾病的发 生与高血压、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相 关，而ace基因中由alu重复序列的存在或缺失的三种基因 型(缺失纯合子dd,插入纯合子ii,杂合子id)与心血管 疾病的发生有关4。因此，鉴于cvd的高发性和危害性， ace基因多态性的检测对于cvd疾病的防治具有重要的意义。在本次研究中，116例受检人员均成功得到扩增产物， 且经

8、验证结果一致。在cvd组73例患者的扩增产物中，dd 型14例，基因频率19. 2%；对照组43例患者的扩增产物中， dd型5例，基因频率11.6%,明显低于cvd组，提示cvd与 ace基因dd型有关，与相关研究相符5。同时有研究表明, ace基因dd型会影响高血压疾病的早期发生，也是心肌梗死发病和左心室肥厚的独立危险因素6。等位基因特异性pcr 作为一种基因突变的测定方法，具有用时短、操作简便、价 格低廉等优点，与pcr-relf方法相比省去了酶切步骤，也 可避免酶切过程中的影响因素，有效提高检测准确性的同时 可降低费用。综上所述，ace基因多态性的基因型检测对于cvd的防 治具有一定的参

9、考意义，而等位基因特异性pcr是对基因多 态性进行检测的有效方法。参考文献1 张啸飞，胡大一，丁荣晶，等中国心脑血管疾病死 亡现况及流行趋势j.中华心血管病杂志，2012, 40 (3)： 179-187.2 holman e a. acute stress and cardiovascular health： is there an ace gene connectionj.j trauma stress, 2012, 25 (5)： 592-597.3 尚青华，徐浩心脑血管疾病危险评估方法学研究进 展j中华老年医学杂志,2011, 30 (5)： 436-438.4 陈秀梅，卢新政.ace基因i/d多态性在心血管疾病 中的研究进展j国际遗传学杂志，2008, 31 (6)： 471-474, 482.5 龚洁，丁新生，陈其元，等.脑卒中患者血管紧张素 转换酶基因缺失多态性分析j.南京医科大学学报(自然科 学版)，2005, 25 (12)： 890-8936 ruey-yun wang, chia-min chung, cathy s j fann, et al