免疫分析法学习教案

1、会计学1免疫免疫(miny)分析法分析法第一页，共57页。一、概述一、概述二、抗原二、抗原(kngyun)(kngyun)三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要主要(zhyo)内容内容第1页/共56页第二页，共57页。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应(fnyng)(fnyng)四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要主要(zhyo)内容内容第2页/共56页第三页，共57页。 免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤(snshng)的机制，研究有效的免疫措

2、施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。一、概述一、概述(i sh)第3页/共56页第四页，共57页。 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内生的特异性结合反应。它既可以发生在体内(t (t ni)ni)，也可以发生在体外。，也可以发生在体外。在体内在体内(t ni)(t ni)发生的抗原抗体反应为体液免疫应答发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于

3、的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。第4页/共56页第五页，共57页。(1) 在实验在实验(shyn)药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有

4、交叉的药物血液浓重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；度进行监测；(3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；含量，以实现对生产过程的在线监测；(4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。在药物分析中，免疫分析法的应在药物分析中，免疫分析法的应用用(yngyng)主要集中在以下主要集中在以下几方面：几方面：第5页/共56页第六页，共57页。非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化非标记免疫分析（抗原抗体结

5、合理化性质发生变化）标记免疫分析标记免疫分析标记物标记物有无有无非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）酶联免疫分析酶联免疫分析荧光免疫分析荧光免疫分析电化学免疫分析电化学免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析免疫分免疫分析析第6页/共56页第七页，共57页。免疫分析检测免疫分析检测(jin c)的发的发展展放射免疫检测（兴起于放射免疫检测（兴起于2020世纪世纪(shj)70(shj)70年年代代) )酶联免疫检测（兴起于酶联免疫检测（兴起于2020世纪世纪(shj)80(shj)80年代，各临床机构普遍使年代，各临床机构普遍使用）；用）；以化学发光为代

6、表的光生物学标记及免疫以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术检测技术（2020世纪世纪9090年代开始推广使用，产年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。品步入成长期）三个阶段。第7页/共56页第八页，共57页。 特点特点可逆性可逆性比例比例(bl)(bl)性性反应阶段性反应阶段性特异性特异性免疫免疫(miny)(miny)分析法的特点分析法的特点第8页/共56页第九页，共57页。特异性特异性特异性：抗原与抗体结合反应特异性：抗原与抗体结合反应(fnyng)(fnyng)的的专一性专一性分子基础分子基础: :抗原表位与抗体分子高变区之间抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性空间

7、构型的互补性第9页/共56页第十页，共57页。可逆性可逆性可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构体均能保持原有的结构(jigu)(jigu)和活性。和活性。影响因素：影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响环境因素对复合物的影响pHpH、离子强度、离子强度 第10页/共56页第十一页，共57页。比例性和比例性和反应阶段性反应

8、阶段性比例性：抗原与抗体发生可见反应比例性：抗原与抗体发生可见反应(fnyng)需遵循一定需遵循一定的量比关系的量比关系前带前带(prezone)：抗体过量：抗体过量后带后带(postzone)：抗原过量：抗原过量等价带等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适：抗原抗体比例合适 第11页/共56页第十二页，共57页。一、概述一、概述二、抗原二、抗原(kngyun)(kngyun)三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要主要(zhyo)内容内容第12页/共56页第十三页，共57页。第13页/共56页第十四页，共57页。第14页/共5

9、6页第十五页，共57页。第15页/共56页第十六页，共57页。第16页/共56页第十七页，共57页。第17页/共56页第十八页，共57页。第18页/共56页第十九页，共57页。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫反应三、抗体与免疫反应(fnyng)(fnyng)四、免疫分析方法及应用四、免疫分析方法及应用主要主要(zhyo)内容内容第19页/共56页第二十页，共57页。第20页/共56页第二十一页，共57页。第21页/共56页第二十二页，共57页。第22页/共56页第二十三页，共57页。第23页/共56页第二十四页，共57页。Fab：抗原：抗原(kngyun)结合片段结合片段Fc：可

10、结晶片段：可结晶片段第24页/共56页第二十五页，共57页。第25页/共56页第二十六页，共57页。第26页/共56页第二十七页，共57页。第27页/共56页第二十八页，共57页。n第28页/共56页第二十九页，共57页。第29页/共56页第三十页，共57页。第30页/共56页第三十一页，共57页。第31页/共56页第三十二页，共57页。第32页/共56页第三十三页，共57页。n细胞培养法细胞培养法 & 接种动物体内接种动物体内生产法生产法第33页/共56页第三十四页，共57页。第34页/共56页第三十五页，共57页。第35页/共56页第三十六页，共57页。n散法、间接血凝法和散法、间

11、接血凝法和ELISA法法等。等。第36页/共56页第三十七页，共57页。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗体与免疫三、抗体与免疫(miny)(miny)反应反应四、免疫四、免疫(miny)(miny)分析方法及应用分析方法及应用主要主要(zhyo)内容内容第37页/共56页第三十八页，共57页。四、免疫四、免疫(miny)分析方法及分析方法及其应用其应用放射免疫放射免疫(miny)分析法（分析法（RIA）荧光免疫荧光免疫(miny)分析法（分析法（FIA）克隆酶给予体免疫克隆酶给予体免疫(miny)分析法（分析法（CEDIA）酶联免疫酶联免疫(miny)吸附分析法（吸附分析法（ELISA）

12、第38页/共56页第三十九页，共57页。放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。准曲线的测量范围也明显扩大。由于由于(yuy)特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应

13、用于本技术，使得免疫放射分析法更加完。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。善。放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术应用最广的一类竞争性体外放射分析技术.第39页/共56页第四十页，共57页。基本原理基本原理 基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量抗原）与有限量(xinling)(xinling)的特异性抗体发生可逆性竞争结合的特异性抗体发生可逆性

14、竞争结合 , ,这种竞争可用以下反应式来表示：这种竞争可用以下反应式来表示： 抗原抗原(kngyun) 抗体抗体常用的标记物：常用的标记物：125 I和氚标记物和氚标记物放射性活度（贝克，放射性活度（贝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰变：每秒一次核衰变(shuibin)比活度（比活度（Bp/g）：）：每单位质量所含的放射性比活度每单位质量所含的放射性比活度游离状态游离状态结合状态结合状态第40页/共56页第四十一页，共57页。具体步骤具体步骤 抗原抗体(kngt)反应结合(jih)的和游离的放射性物质的分离放射性活度的测定(cdng)柱色谱法柱色谱法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗体发抗抗体发微孔滤

15、膜法微孔滤膜法固相法固相法求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）第41页/共56页第四十二页，共57页。荧光荧光(ynggung)免疫分析法（免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA） 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和 敏感性与显微示踪的精确性相结合的一项技术 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响(yngxing)其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原第42页/共56页第四十三页，共57页。荧光荧光(ynggung)免疫分析法（免疫分析法（Fluorescence

16、immunoassay, FIA） 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位 在实际(shj)工作中，由于荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术第43页/共56页第四十四页，共57页。根据实验方法(fngf)分类直接法间接法补体(bt)法其他第44页/共56页第四十五页，共57页。直接直接(zhji)(zhji)法法将荧光标记的特异性抗体（抗原(kngyun)）直接加在抗原(kngyun)（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗-干燥-封片-镜检操作简便、特异性高、非特异性染色少敏感性低抗原(kngyun)标记抗体荧光第45页/共56页

17、第四十六页，共57页。间接间接(jin ji)(jin ji)法法先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成(xngchng)抗原-抗体-抗体复合物，水洗-干燥-封镜-镜检未知抗原未知抗原(kngyun)未标记抗未标记抗体体标记抗体标记抗体荧光荧光第46页/共56页第四十七页，共57页。补体(bt)法利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射(fsh)荧光补体补体(bt)标记抗补标记抗补体抗体体抗体第47页/共56页第四十八页，共57页。时间分辨(fnbin)荧光免疫测定 利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形

18、成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去(ch q)未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。第48页/共56页第四十九页，共57页。基本原理基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物与酶连接，然后通过酶与底物(d w)(d w)产生颜产生颜色反应，用于定量测定。色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或

19、抗体（标记物）酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物酶作用的底物(d w)(d w)（显色剂）（显色剂）酶联免疫吸附分析法（酶联免疫吸附分析法（ELISA）第49页/共56页第五十页，共57页。第50页/共56页第五十一页，共57页。 双抗体夹心法，属于非竞争(jngzhng)结合测定。 它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 实验原理实验原理 双抗体双抗体(kngt)夹心法夹心法第51页/共56页第五十二页，共57页。第52页/共56页第五十三页，共57页。酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化(ynghu)物酶(horseradish peroxidase, HRP)和