乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值ppt课件

1、 乙型肝炎病毒cccDNA 检测方法与运用价值第二军医大学长征医院第二军医大学长征医院缪晓辉缪晓辉2005.10一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介什么是什么是HBV cccDNA?HBV cccDNA? 即共价闭合环状即共价闭合环状DNADNAcovalently covalently closed circular DNA)closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染形状，主细胞后在细胞内复制并建立感染形状，病毒松弛环状病毒松弛环状DNADNArcDNArcDNA进入细胞核，进入细胞核，利用宿主利用宿主DNADNA聚合酶和拓扑酶

2、等聚合酶和拓扑酶等“修复构修复构成的、构造完好的、超螺旋双链成的、构造完好的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙型肝炎病毒基因组构造表示图乙型肝炎病毒基因组构造表示图乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注我们为什么要关注HBV cccDNA?HBV cccDNA? cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制复制“池池 目前尚没有可以进入细胞核内，并可以去除目前尚没有可以进入细胞核内，并可以去除cccDNA 的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治和治 疗后容易复发的缘由之一疗后容易复发的缘由之

3、一 肝脏以外器官组织细胞能够存在肝脏以外器官组织细胞能够存在cccDNA，成为肝脏成为肝脏 移植术后乙肝复发的来源移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定、可靠、敏感的还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试检测试剂盒问世剂盒问世为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世? ?研讨和开发该检测技术的时间不长研讨和开发该检测技术的时间不长检测技术上的难度较大检测技术上的难度较大前期研讨主要集中于细胞模型和动物肝脏前期研讨主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求模，不能满足临床检验的需求现有技术灵敏度不高，检测低限现有技术灵敏度不高，检测低限104 cop

4、y104 copy /ml /ml左右左右分研讨机构和学者对检测技术的特异性认分研讨机构和学者对检测技术的特异性认 识缺乏，存在缺陷识缺乏，存在缺陷多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存(cccDNA(cccDNA、 rcDNA rcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBV DNAHBV DNA，必需有，必需有 效地分别效地分别cccDNAcccDNA和其他类型的病毒和其他类型的病毒DNADNA如何进一步处理特异性的问题？如何进一步处理特异性的问题？如何处理灵敏度不高的问题细胞内如何处理灵敏度不高的问题细胞内cccDNAcccDNA 含量的较低，血清中含量？

5、含量的较低，血清中含量？如何简化检测步骤？如何简化检测步骤？建立建立cccDNAcccDNA检测技术必需抑制的难点检测技术必需抑制的难点cccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一级结构核酸一级结构完整的双链完整的双链两条链均不完整两条链均不完整核酸空间结构核酸空间结构闭合环状，超螺旋闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合不结合不结合共价结合共价结合对某些核酸酶抗性对某些核酸酶抗性强，不容易被降解强，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分别分别cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的分子根底的分子根底分别分别cccDNAcccD

6、NA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差别的任何手段均基于上述差别二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者探针法侵入者探针法Invader assaayInvader assaay3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)

7、2.2.侵入者探针法侵入者探针法Invader assaayInvader assaay3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法设计一对特殊引物：跨双缺口引物设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物正义引物P1 P1 ：与负链互补结合，位于正：与负链互补结合，位于正 链缺口上游链缺口上游 反义引物反义引物P2 P2 ：与正链互补结合，位于负：与正链互补结合，位于负 链缺口下游链缺口下游目的：目的：rcDNArcDNA不被扩增不被扩增1.1.选择性选择性PCRPCR选择性选择性PCR：rcDNA不被扩增不被扩增选择性选择性PCRPCR：cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增PCR产物本

8、身退火产物本身退火self annealing“选择性选择性PCRPCR：并非万无一：并非万无一失失l 国内外许多研讨者忽略了这个问题，国内外许多研讨者忽略了这个问题，rcDNArcDNA被大被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠l Hepatology Research 2003;15: Hepatology Research 2003;15: 234-243234-243PBMCPBMCl W o r l d J G a s t r o e n t e r o l W o r l d J G a s t r o e n t e r o l 20

9、04;10(1):82-85(2004;10(1):82-85(血清血清) )l Kock Kock等：反响管中等：反响管中rcDNArcDNA含量不能超越含量不能超越105copy105copyl Hepatology Hepatology 1996;23:405-4131996;23:405-413l 我们的阅历：我们的阅历：l 血清血清HBV rcDNAHBV rcDNA超越超越108copy/ml108copy/ml，进展荧光，进展荧光PCRPCR能够会出现检测结果假阳性能够会出现检测结果假阳性“选择性选择性PCRPCR：并非万无一：并非万无一失失 与定性法比较添加了一个荧光探与定性法

10、比较添加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区负链缺口针，探针位于扩增片段区负链缺口下游，与下游，与cccDNAcccDNA的负链互补。的负链互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNArcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+ 32001EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时

11、荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理l 规 范 曲 线 方 程规 范 曲 线 方 程 Y C t = 4 2 . 0 8 2 7 -Y C t = 4 2 . 0 8 2 7 -3.5554logXcopy3.5554logXcopyl 相关指数：相关指数： R2=0.995R2=0.995l 灵敏度至少可以到达灵敏度至少可以到达103copy/ml 103copy/ml 我们的结果我们的结果 ： 选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA同样存在同样存在PCRPCR产物本身退火引起的产物本身退火引起

12、的rcDNArcDNA 非特异性扩增的问题非特异性扩增的问题由于灵敏度较普通由于灵敏度较普通PCRPCR高，假阳性率比普高，假阳性率比普 通通PCRPCR更高更高缺陷：缺陷：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA质粒规范品质粒规范品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清携带者血清质粒规范品质粒规范品105copy/ml105107copy/ml携带者血清携带者血清选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA处理方案处理方案l 特异性抽提分别特异性抽提分别cccDNAcccDNA与其它方式的病毒与其它

13、方式的病毒DNADNAl 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法l 酶切纯化酶切纯化cccDNAcccDNAl 采用绿豆核酸酶或采用绿豆核酸酶或ATPATP依赖的依赖的plasmid-safe DNAplasmid-safe DNA酶酶选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)侵入者探针法侵入者探针法Invader assaayInvader assaay3.3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种c

14、ccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介2.2.侵入者探针法侵入者探针法(Invader assay)(Invader assay)两个体系：两个体系： 两种特殊的探针：两种特殊的探针：invader probeinvader probe和和primary primary probeprobe，后者含与待测模板无关的，后者含与待测模板无关的5 5侧翼的碱基片段。侧翼的碱基片段。 荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶 (cleavase,(cleavase,裂解酶裂解酶) )特异地切割特异地切割5 5侧翼碱基片段作为第侧翼碱基片段作为第二个二个invader

15、invader，与荧光共振能量转移盒，与荧光共振能量转移盒FRETCFRETC结合结合，裂解酶切割，裂解酶切割FRETCFRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。信号。特点：一个模板可以反复运用，每特点：一个模板可以反复运用，每“结合结合裂解裂解结合结合裂解一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光裂解一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大信号，呈线性信号放大侵入者探针法定量检测侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺的优缺陷陷优点：线性信号放大，特异性比荧光优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCRPCR法强法强缺陷：灵敏度低：缺陷：灵敏度低：1

16、04copy/ml104copy/ml1.1.选择性选择性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光、荧光PCR)PCR)2.2.侵入者分析法侵入者分析法Invader assaayInvader assaay嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介3. 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCR法法Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52+PNN：与：与HBVDNA非同源片段非同源片段5N533p+rcDNAcccDNAPNNP253533. 嵌合引物荧光嵌合引物荧

17、光PCR法法 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR的优缺陷的优缺陷 优点：抑制了荧光优点：抑制了荧光PCRPCR法的部分缺陷，灵敏法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高度比侵入法提高 缺陷：仍不能完全防止待测标本中存在的缺陷：仍不能完全防止待测标本中存在的 rcDNArcDNA被非特异性扩增被非特异性扩增 无论是选择性荧光无论是选择性荧光PCRPCR，还是侵入者探，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光针法或嵌合引物荧光PCRPCR，本身都不能处理，本身都不能处理在高在高rcDNArcDNA背景条件下的假阳性问题，必需背景条件下的假阳性问题，必需结合抽提分别、酶切纯化等步骤，以提高特结合抽提分别、酶切纯化

18、等步骤，以提高特异性。异性。三、影响三、影响cccDNA池的要素池的要素1.cccDNA1.cccDNA池的本身恒定池的本身恒定 cccDNA cccDNA池：感染肝细胞核内池：感染肝细胞核内HBV cccDNAHBV cccDNA的的 含量在无外来干扰的情况下保含量在无外来干扰的情况下保 持恒定持恒定(5(550copy/cell)50copy/cell) 病毒本身调理：关于病毒的进化病毒本身调理：关于病毒的进化 关于病毒的关于病毒的“思想思想 病毒本身的调理病毒本身的调理 外来压力：突破病毒含量本身恒定的结果外来压力：突破病毒含量本身恒定的结果2.2.抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAc

19、ccDNA的影响的影响l现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少似物，可以一过性地减少cccDNAcccDNA，但均不能，但均不能去除去除cccDNAcccDNAl细胞核内细胞核内cccDNAcccDNA含量的相对稳定性，决议了含量的相对稳定性，决议了长疗程抗病毒治疗的必要性长疗程抗病毒治疗的必要性抗病毒药物抗病毒药物研究者研究者模型模型干扰素干扰素 SchultzSchultz等等 原代鸭肝细胞原代鸭肝细胞拉米夫定拉米夫定 MasonMason等等 土拨鼠土拨鼠 AddisonAddison等等 北京鸭北京鸭 阿德福韦阿德福韦Dand

20、riDandri等等 土拨鼠土拨鼠DelmasDelmas等等 北京鸭北京鸭L-Fd4C L-Fd4C ZoulimZoulim等等 原代鸭肝细胞原代鸭肝细胞抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAcccDNA的影响的影响文献举例文献举例阿德福韦治疗阿德福韦治疗4848周结果周结果Hepatology 2005;42:302-308举例举例3.3.肝外组织也是肝外组织也是cccDNAcccDNA的储存池？的储存池？肝外组织细胞中肝外组织细胞中HBVHBV标志的存在情况：标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、膜、皮肤、睾

21、丸、前列腺、唾液腺、PBMCPBMC 等组织或细胞中均检测到等组织或细胞中均检测到HBVHBV的标志物的标志物HBVHBV吸附？暂居？建立感染形状？吸附？暂居？建立感染形状？ 根据：从上述组织细胞中检测到根据：从上述组织细胞中检测到cccDNAcccDNA， 但必需处理检测技术问题但必需处理检测技术问题(1)(1)有关有关PBMCsPBMCs中中cccDNAcccDNA检测的研讨检测的研讨结结 论论研究者研究者发表杂志发表杂志PBMCs中不存在中不存在cccDNAKock等等 Hepatology 1996刘茂昌刘茂昌 等等中华肝脏病杂志中华肝脏病杂志 2004PBMCs中存在中存在cccDN

22、A赵克开、郝勇赵克开、郝勇 等等Stoll-Becker未发表未发表J. Virol 1997CabrerizoHepatology 2000ToriiHepatol Res 2003PBMCsPBMCs中中cccDNAcccDNA检测结果不一的缘由检测结果不一的缘由方法学的问题方法学的问题: : 假阳、阴性率？灵敏度？假阳、阴性率？灵敏度？ 目前报道阳性结果者均采用套式目前报道阳性结果者均采用套式PCR PCR ！研讨模型的选择？研讨模型的选择？病毒要素？病毒要素？细胞数量的多少？细胞数量的多少？其他：免疫功能形状、实验室条件等其他：免疫功能形状、实验室条件等(2)(2)关于血清中能否存在关于血清中能否存在cccDNAcccDNA