现代生物实验原理与技术

1、方泽民：蛋白质表达技术DNA重组表达：在合适表达元件（如转录启动子、终止子、翻译调控序列、转录酶、翻译因子等）调控下，目的基因表达成目的蛋白质的技术。外源基因在大肠杆菌中的表达：大肠杆菌表达外源基因的优势：1、全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2、基因克隆表达系统成熟完善3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势： 1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 2、 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 3、 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 4、 细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌表达载体分类：按蛋白质类型分：

2、单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分：lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导lamda phage PL和PR 启动子 热诱导T7 启动子 IPTG诱导T5 启动子 IPTG诱导ara启动子 阿拉伯糖诱导选择表达系统：1. 蛋白质的大小：小的胞质蛋白和多肽最好能与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解，并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白

3、酶在融合蛋白的适当位置进行切割，可以回收有活性的靶蛋白。2. 蛋白质的需要量：如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物来分析，一般不需要进行优化表达。3. 蛋白质是否需要保留活性：（1）若只用于生产抗体，包涵体有利于分离。（2）若靶蛋白用于生物化学或细胞生物学研究，就要考虑活性，其次考虑纯化问题。（3）若要用于结构研究，最好能以可溶性状态表达。外源基因在大肠杆菌中的表达：外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理： 转录： 启动子、 终止子、核糖体结合位点 翻译： 密码子、质粒拷贝数启动子：Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理： 具有多顺反子结

4、构，基因排列次序为：启动子（lacP）- 操纵基因（lacO）- 结构基因（lacZ-lacY-lacA）、正调节因子 CAP、 负调节因子 lac I 正调节因子 CAP ： cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 lac UV5 突变体： Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在

5、使用时比野生型 Plac 更易操作。负调节因子 lac I ： 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。Trp 表达系统： 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理： 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达Tac 表达系统：tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 l

6、acUV5 的 10 序列拼接而成的杂合启动子调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。lac、tac 启动子对宿主菌的要求： 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子转录调控的需要。当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一个 lacO 都能获得足够的 L

7、acI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。 lac、tac 表达系统存在的问题 ：

8、IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。 一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法： lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录PL 和 PR 表达系统： 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为核心构建的表达系统在野生型 l 噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。转录调控的机理： 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是

9、PL 、 PR 启动子转录阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录。 在较低温度（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL 或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。 对宿主菌的要求： 用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌N48

10、30-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大PL 和 PR 表达系统存在的问题： 由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。 缺陷： 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30提高到 42 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量

11、有一定的影响。T7 表达系统： 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。含T7噬菌体启动子的表达载体：在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控：带有pBR322的大肠菌素E1（colE1）复制区，从而使宿主菌有氨苄青霉素或卡那霉素抗性。外源基因插入多克隆位点，置于天然T7RNA聚合酶启动子或T7 lac启动子的控制之下。T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快 5倍左

12、右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转录的序列 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。转录调控的机理： T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统转录调控的机理： 化学诱导型： 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生株，一段含有 lacI、lacUV5 启动子和 T7 RNA 聚合酶基因 DNA 片段被插入其 int 基因中用噬

13、菌体 DE3 的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。温度诱导型： PL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。双质粒系统： 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带有 T7 启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制 T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型T7 表达系统存在的问题： T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因

14、产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。 解决办法之一： 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因。因为 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。目前 T7 溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。 其他表达系统：营养调控型： 采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因 phoA 启动子或甘油 3-磷酸转移系 统 ugp 启动子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi5mmol/L时抑制，Pi1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。糖原调控型： 采用的

15、有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC) mgl 启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因 araB 启动子构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于 Lac 表达系统.pH调控型： 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。 cadA 启动子受培养基中 H+ 浓度，即 pH 值调控。（在pH8 时抑制，pH 6时激活，pH = 6时转录活力最高）。 该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 30 之间才能使目的基因得到稳定的表达.溶氧调控型： 采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子，硝基还原酶基因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白

16、基因 vgb 启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子 fnr 的作用位点。在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。大肠杆菌 GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下的 T7 RNA 聚合酶基因表达质粒， vgb 基因的转录是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下 vgb 基因的启动子被激活。 因此，用大肠杆菌GJ100 作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧诱导型， 菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节，与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。生物素调控型： 用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程中生物素会不断消

17、耗，当浓度到达 2ng/ml 以下时启动子被激活。能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。终止子：强化转录终止的必要性： 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标记

18、基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率强终止子的选择与使用： 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用核糖体结合位点：核糖体结合位点： 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决

19、于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部

20、分基因以 AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于 SD （ UAAGGAGG）序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T，均会导致翻译效率大幅度降低SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的精确距离

21、保证了 mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物结构中的 P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同程度的降低起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5 端非编码区形成茎环结构，否则便会

22、严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。密码子：生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体X174）基因组中，密码子 第三位上的 U 和 A 出现的频率较高；在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的简并密码子占 90% 以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能中等强度规律 如GGG、CCC、GC

23、G、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多细胞内 tRNA 的含量密码子偏爱性对外源基因表达的影响： 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成同步表达相关 tRNA 编码基因质粒拷贝数：质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过

24、程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道外源基因在大肠杆菌中的表达：目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的20%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒（存在于大肠杆菌细胞质） 在细胞内表现为可溶性的蛋白质（存在于细胞质中外，还可分泌到周质空间）包涵体

25、型异源蛋白的表达：包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

26、能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。分泌型异源蛋白的表达在细胞内表现为可溶性的蛋白质 目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部份

27、被转运到细胞的其他部位。这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。 解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因 trxB 缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB 缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化，蛋白质在 trxB 缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具。在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质 在细胞质中直接表达不带有前导序列的成熟蛋白质需要起始密码，通常为编

28、码甲硫氨酸的ATG。 在多数情况下，N端附加的甲硫氨酸对蛋白质的性质没有特别的影响，但是也有附加的甲硫氨酸严重影响蛋白质生物学活力的报道。 另外，附加的甲硫氨酸也可能改变蛋白质的免疫性质和药理性质。从制备用于医疗目的的蛋白质的角度来看，这是一个需要引起重视的问题。去除附加的甲硫氨酸有二种方法： 在表达系统中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因。 在分离纯化后在体外用外肽酶处理。 但它们都对与甲硫氨酸相邻的氨基酸残基类型有一定要求，因此在使用上有一定的限制。目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。 目

29、标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。 金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。目标蛋白在周质空间中表达目标蛋白在周质空间中表达的优点 大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为 100 种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含量与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。 目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的产生

30、。 周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。高效表达目标基因的战略和技术：表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞表达质粒的优化和设计： 在各种表达载体中，启动子和 SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目标基因的插入。这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对于构建高效表达质粒是至关重要的。 由于每一个基因都具有各自独特的 5 端结构，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量。构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻

31、译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高36倍翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 68 个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是57 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才能进行ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 表达水平高的基因呈

32、现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的 tRNA 的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。 解决这一问题的办法： 通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性 由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因 mRNA 和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不

33、同的，具有一定的专一性和选择性。蛋白水解酶的特点 细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内蛋白质的半衰期进行统计学分析，发现 N末端为Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 残基的蛋白质，含有Pro、Glu 、Ser 、Thr 丰富区的蛋白质容易降解，稳定性较 差在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白水解酶活力往往能达到比较高的水平。提高目标蛋白的稳定性的措施主要有： 利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因

34、的缺陷株作为宿主菌。 对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。 共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。 对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。 在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的较运和分泌效率一般比较低，不能满足大规馍制备的需要。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速率慢，使高密度发酵比较困难。 融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致生物比活力降低，甚至没有活性。 融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂

35、解试剂有毒性。 对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据，而目前这方面的数据库还不完整。高密度发酵和工程化宿主细胞 大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。 目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌： 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题

36、。 虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从恨本上解决问题的途径之一。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因 vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。 用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断。 改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰

37、乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋日而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对蛋白水解酶比较敏感的目标蛋白也能获得较高水平的表达，需要构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。 rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA 聚合酶的 r32 亚基， r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。 rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。到目前为止，已知

38、的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都巳被获得，其中一部分具有实际应用的潜力。甲醇酵母表达系统：甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。毕赤酵母（Pichia pastoris)汉森酵母（Hansenula ploymorpha)假丝酵母（Candia boidinii) 甲醇氧化酶：A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上。B、名称和拷贝数不同毕赤酵母/假丝酵母 汉森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶alcohol oxidase, AOX methanol oxidase, MOXAOX1、AOX2 MOX 甲醇氧化酶启动子A、目前已发现的、最强的

39、真核启动子B、严谨调控型启动子AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导。MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导 甲醇酵母表达系统的优缺点A、表达水平高（最高水平的系统）B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150个甘露糖）D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统）E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。F、实验室和工业操作简单G、不能满足结构要求严格的糖基化甲醇酵母表达系统操作原理：宿主株与标记基因、甲醇酵母系统的整合事件、胞内表达与分泌表达甲醇酵母系统的整合事件：YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重

40、组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。YIp型载体：A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组B、有“插入”和“取代”二类整合模式C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策：1、载体稳定性同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高YRp型载体的稳定化：选择非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚2、基因剂量外源基因表达存在基因剂量效应3、筛选多拷贝整合子1. 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。2. 体外

41、串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子3. 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子4. 构建高拷贝整合型表达载体4、整合位点外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低5、甲醇利用表型在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达6、mRNA5端mRNA5端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构7、AT含量分泌信号AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构；分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MF、PHO或SUC等的信号肽，或野生型信号肽，但适用性要比

42、较分析。表达蛋白的检测：酶活力测定、SDS-PAGE、Western blotting肖亚中：RNA技术RNA分子特征：A/U/C/G构成，核糖的2¢ 位子为-OH，在碱性条件下不稳定； 为单链分子，内部易形成二级结构，普通电泳不能显示其真实大小，应使用甲醛变性电泳检测； 胞内外存在有多量RNA酶，该酶极稳定，RNA易受其降解。RNA处理：RNA酶无处不在： RNA酶稳定性极高，仅SDS或苯酚不能使其完全失活；酶活性也不依赖于金属离子，EDTA无作用；RNA酶热稳定好，煮沸不能失活。避免RNA酶降解：创造不利于酶活性发挥的环境！使用专用试剂、器械；使用专用环境/台柜；使用RNA酶活抑

43、制剂。常用RNA酶活抑制剂：焦碳酸二乙酯(DEPC)：高活性的烷化剂，可不加选择的修饰蛋白质和RNA,用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNA酶。分离和纯化RNA过程不用。易挥发致癌，通风橱操作。酶的蛋白质抑制剂(RNasiin)：从人胎盘组织分离的蛋白质，分子量约50KD，单一多肽，可与多种RNA酶紧密结合形成非共价等摩尔复合物使其失活。使用时至少需要1mM DTT存在才有抑制活性，最适pH5-8。常-20 °C保存于5mM DTT的50%甘油中。不同公司产品商品名不同，易变性失活。氧钒核糖核苷复合物(VRC)：与多种RNA酶活性位点结合，几乎全部抑制酶活性。不能共价修饰RNA酶，故在提

44、取纯化RNA的全过程都需添加，浓度10mM。器皿和试剂的处理：干热灭菌：玻璃、金属及耐热品，用RNA酶去除剂洗涤后铝箔包裹，180-200 °C 4小时以上；湿热灭菌：一次性塑料品等，灭1-2小时；无菌水也用此法灭，盛水器皿先干热灭菌； DEPC处理水：用灭菌水配成0.1%浓度，室温或37 °C 12h处理，后打开瓶口，高温高压20min灭菌处理2次；RNA酶去除剂：玻璃、塑料品用2% Absolve（Dupout公司）浸泡过夜，再无菌水漂洗、干燥。RNA质量检测：吸光度检测：A260/A280在1.8-2.0范围内；电泳检测：28S和18S条带清晰，两者亮度比值在2倍以上

45、；保温检测：70 °C保温1h，电泳检测没有新降解RNA制备（一）AGPC法（acid-guanidine-phenol-chloroform）：原理：核酸在酸性水溶液中亲水性低，酸性酚抽提时，DNA溶于酚相，RNA溶于水相，据此用于少量RNA制备。RNA制备（二）NP-40法（Nonidet P-40）：原理：细胞置于低渗压下，吸水膨胀处于易裂解状态，用表面活性剂(乙基苯基聚乙二醇)可提出胞质RNA。适用于RNA少量制备，不易被RNA酶降解，也不易被基因组DNA污染。RNA制备（三）试剂盒法：QIAGEN Co. RNeasy 试剂盒RNA纯化：前述提取的RNA为总RNA，rRNA

46、占80-85%, tRNA占10-20%, mRNA仅2-5%，甚至更少;真核生物mRNA在被转录时，其3¢-端总是被添加一些腺苷酸，形成聚腺苷酸尾，而rRNA与tRNA不具有Poly(A)尾。oligo(T) 磁珠法：poly(A) 与poly(U) 或poly(T)能退火配对，将后者固定，可用于吸附纯化poly(A) +mRNA。oligo(dT)×纤维素法纯化poly(A)+ mRNA复习思考题1. 有哪些RNA提取方法？其主要原理是什么？RNA提取过程中如何防止RNase污染？2. 如何进行RNA的电泳检测？如何通过电泳图谱判定RNA质量？3. 简述纯化poly(A

47、)+RNA的基本原理？4. 为何要纯化poly(A)+RNA？操作过程中需要注意哪些问题？1 cDNA文库 通过一系列酶催化使总poly(A) mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并重组于适当的载体分子，转化大肠杆菌细胞，便构成了包含所有基因编码序列的cDNA文库。2 cDNA克隆法 运用cDNA文库技术，以mRNA为模板合成双链DNA，并对真核生物基因进行克隆的技术。3 cDNA文库构建 （1）细胞总RNA的制备及mRNA的纯化 是进行cDNA文库构建的第一步。从供体细胞制备总RNA相对容易，但总RNA中含有大量的tRNA和rRNA，mRNA含量相对较少(一般占2-5%)，文库构建时一般需用

48、纯化的mRNA分子。mRNA纯化方法：真核基因mRNA分子的3-末端都有一段poly(A)尾巴，可用一段偶联于惰性物质(纤维素/琼脂糖)的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸oligo (dT)通过吸附层析进行纯化。 纯化程序： 制备oligo(dT)×纤维素层析柱，使总RNA流过纤维素柱，mRNA的Poly(A)尾巴与oligo(dT)序列杂交而吸附于柱上，rRNA和tRNA流过柱子，用100mM NaCl充分洗脱rRNA和tRNA分子，再用10mM Tris/1mM EDTA洗下含有目的mRNA的部分。2）合成第一链cDNA 通常有两种方法： 一种是oligo(dT)引导法； 另一为随机引物引

49、导法 (randomly primed cDNA synthesis) 目前普遍采用后一方法。 oligo(dT)引导法: 利用真核生物mRNA分子具有poly(A)尾巴的特性，先用12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，与上述制备的mRNA分子混合(杂交)，并以其作为引物，在反转录酶作用下，以mRNA分子为模板合成cDNA第一链。 该反应产物为DNA/RNA杂交分子，此法有一定局限性，即：对于大分子的mRNA第一链cDNA合成效率低。因为这种方法进行cDNA合成时，必须从3-末端开始，而逆转录酶较难有效到达长的mRNA分子的5-末端。随机引物引导cDNA合成法 能克服上述

50、方法不足。 使用根据许多可能序列合成的寡聚核苷酸片段混合物(6-10 bp)，作为合成第一链的引物，cDNA的合成可从mRNA模板的许多位点同时进行，对于长的mRNA分子也比较有效。 （3）双链cDNA分子的生成 从mRNA/DNA杂交分子合成双链cDNA分子也有多种方法： 自我引导法 RNaseH 酶解取代法，等， 其中自我引导法是最经典方法，现仍常用。自我引导法实验程序：先用碱处理，将mRNA模板水解，使第一链cDNA游离出来，并在其末端自发形成发夹环结构 (hairpin loop)；再以此结构为引物，引导cDNA第二链合成，产生含有一个完整发夹环结构的双链cDNA；之后用S1 核酸酶切

51、割处理，去除单链部分，得到双链的cDNA分子。但该方法受S1核酸酶纯度影响，往往会使得到的双链 cDNA丢失原有mRNA 的5-端的许多序列，目前已被下述方法所取代。 RNaseH 酶解取代法 RNaseH 酶能识别 mRNA/DNA中的mRNA组分，并将其降解成许多短碎片，这些片段仍能与第一链cDNA分子杂交，故可作为DNA聚合酶 I 活性的引物。因此，可利用原来的cDNA第一链合成第二链cDNA。当然，此情况下合成的第二链 cDNA分子是处于间断不连续的状态(存在有许多切口)，但通过DNA连接酶连接后，即可转化为连续完整的双链cDNA分子。 RNaseH 降解取代法合成双链cDNA，基本上

52、不丢失从 mRNA分子5-端开始的全部核苷酸序列。（4）全长cDNA合成的方法 oligo(dG)引导合成法在第一链cDNA分子未与mRNA模板分离前, 先在其3-端加上一段oligo(dC), 碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA分子发生水解，收回cDNA第一链，再以互补的oligo(dG)作引物，引导第二链cDNA合成，可避免发夹环结构和使用S1核酸酶引起的克隆序列部分缺失。 载体引导合成法因第一链cDNA由参入到载体分子的oligo (dT)作引物引导合成而得名。 制备3-末端具有oligo(dT)质粒引物, 进行反转录合成cDNA第一链, 并在3-端生成oligo(dG)；降解mRNA，富集全长DNA分子，变性；另制备3-末端具有oligo(dC)质粒DNA，变性后与前者混合退火，经聚合酶作用后转化 E.coli 细胞。 置换合成法是有效的全长cDNA合成法， 分三步： 第一步：制备质粒引物(plasmid primer)和具有oligo(dG)尾巴的接头DNA (adaptor DNA) 第二步：构建质粒cDNA重组体分子 第三步：去除mRNA分子，合成第二链cDNA （5）cDNA文库生成 用载体(质粒/噬菌体)将双链cDNA重组，将重组体DNA转入寄主细胞，获得重组体细胞群体。 cDNA