经典许旺细胞检测与鉴定方法的新进展

1、经典许旺细胞检测与鉴定方法的新进展许旺细胞检测与鉴定方法的新进展【摘耍】许旺细胞在周围神经损伤修复过程中起着重要作用， 为保证高质量、高数量、高纯化度的许旺细胞，本篇将对许旺细胞的 精确检测和鉴定的新进展作以综述。许旺细胞的检测、鉴定技术正日 臻完善，不断提高，但仍缺乏系统性。许旺细胞的活性检测町分为 mtt法，显微分光光度和显微图像分析技术，h3-胸腺卩密睫核昔测定， 以及dna受损程度的测定（单细胞凝胶电泳）。此外，许旺细胞的鉴定 分为形态学观察和免疫学鉴定两利j上述各种技术的主耍目的是讣许 旺细胞更有效的在人工组织修复损伤的周围神经再生方面发挥作用, 并在功能和特点上进一步完善。【关键词

2、】许旺细胞；检测；鉴定；综述文献组织工程化神经桥接体的构建过程中，高质量、高数量体外培养 的许旺细胞是至关重要的，近年来许旺细胞的实验研究与日俱增，但 在体外培养和纯化过程中无法避免成纤维细胞的生长。在有大量成纤 维细胞的环境中，如何精确检测许旺细胞的各项功能指标以保证许旺 细胞良好的生长活性并准确鉴定哪些培养细胞为许旺细胞。这将为许 旺细胞的进一步分离和高质量、高数量、高纯化度的提取及应用奠定 理论基础，以更好的应用于周围神经损伤后神经桥接体的构建。本篇 文章应用计算机检索pubmed和cnki2000-2007相关文章，对许旺细 胞的检测与鉴定做系统的综述。1基质干细胞诱导为许旺细胞过程中

3、的特征变化2003年，王剑等⁸在用成人骨髓基质干细胞诱导 分化许旺细胞的实验过程中观察，hmscs经bha作用3h后，细胞体 积明显变小，部分细胞呈高折光率，立体感增强；部分呈橄榄状，两 极有细长突起；部分细胞呈小圆形，有数个细丝状胞突呈放射状分布; 部分细胞呈狭长柱状，两极生出多个平行的细丝状胞突；部分细胞漂 浮、死亡。hmscs继续经ra作用3 d后，细胞体积进一步缩小，呈 橄榄状细胞增多，部分细胞两极有“芽突状”突起形成，并相互连接 形成类似“突触状”结构。此时细胞与背景颜色接近，边界不分清 晰，但立体感明显，胞体狭长。然后hmscs继续经f

4、orskolin> bfgf. pdgf和iirg诱导，部分细胞体积明显变小，外观狭长，立体感增强， 部分胞体周围有“亮晕”形成，胞体两极岀现细长胞突，随细胞数 目增多而呈平行排列，且胞突间首尾相接。2许旺细胞各项活性检测组织工程支架材料上许旺细胞的成活状态及生物活性是移植体 成功与否的关键。随着近年组织工程技术的发展，如何方便、准确地 评价支架上许旺细胞的活性，如细胞的形态、分裂和增殖、dna受损 程度、细胞对基底材料的附着等成为急需解决的问题。本篇将对mtt 法，显微分光光度和显微图像分析技术，h3-胸腺卩密噪核甘测定，以 及dna受损程度的测定伸细胞凝胶电泳）进行对比，从多个角度检

5、测 支架材料上许旺细胞的活性。2. 1许旺细胞增殖能力的测定2. 1. 1 mtt 测试 2002 年，胡唏棠等⁶用 mtt 法 从成年大白鼠坐骨神经分离培养许旺细胞并检测活性。mtt的化学名 称为漠化-3-（4, 50二甲基-乙-嗪呼基）2, 5-二苯基四氮呼，它是一 种显示活细胞线粒体脱氢酶的四醴盐，即能被活细胞线粒体脱氢酶还 原形成蓝色的结晶体-甲攒（formazan） o如果细胞数量较多，细胞半 长良好，线粒体功能旺盛，则线粒体上的脱氢酶含量就高，与mtt作 用后所形成的甲攒量也多，反z，所形成的甲攒量少。2. 1. 2 h3-胸腺u密睫核

6、甘测定胡唏棠等利用同位素h3标记胸腺喘噪核甘测定，可作为dna合 成物的检测，从而量度许旺细胞增殖的活力。测试h期与mtt测试同 步进行，按cheungt j的方法。每项实验重复3次。实验所得结果经spss和excel软件运用t检验等进行统计学处理及制图。2. 1. 3显微分光光度技术和显微图像联合分析技术 （micro-spectrophotometer and micro-imaging analysis）2002年，李文萍等¹⁰利用显微分光光度技术和显 微图像联合分析法对许旺细胞在人工神经支架材料上三维培养的体 外活性进行了研究。显微分光光度

7、和显微图像分析技术，可以在细胞 水平上对细胞成分进行定性、定量、或局部定位分析，它把定性细胞 化学方法推进到数值化局部定量的研究范围，利用该技术可对细胞实 现快速、灵敏度高和抗干扰能力强的显微样品分析。以往二维的图像 分析法由于受许旺细胞突触的厚度及突触的空间折叠影响，当许旺细 胞的生长密度较大吋，无法准确描述其生长状况。由于三维培养的许 旺细胞处于不同的成像焦面，所以其仝长活性的在位检测难以实现， 把它消化下來，贴壁生长后行抗s-100蛋口单克隆抗体免疫组化染色, 检测许旺细胞的s-100蛋白表达量、单位面积内细胞分化数、突触生 长面积网化度，结果显示许旺细胞的生长、增殖情况。2. 2许旺细

8、胞dna受损程度的测定（彗星检测）李文萍等¹⁰应用单细胞凝胶电泳技术测定了许旺 细胞dna受损的程度。单细胞凝胶电泳（single-cell gel electrophoresis, scge）是一种利用碱性条件溶解细胞进行电泳的 dna断链检测技术，具有敏感、快速、简便、重复性好、低耗等特点， 是近年来流行的dna损害检测方法。细胞dna受损后会引起dna的高 级结构变化，其超螺旋结构松散。这种细胞经原位裂解、dna解链等 过程后，电泳吋，损伤的dna从核中移出，朝阳极方向迁移，呈现尾 形分布，而未损伤的dna部分保持球形，荧光染色后观察所构成彗

9、星 状图样。d7a迁移距离（表现为彗星长度）和dna含量（荧光强度）分布 与dna损伤程度相关。3许旺细胞的鉴定3. 1显微镜形态观察murray首先描述了许旺细胞形态学及免疫组化鉴定许旺细胞形 态学特征，典型特征为梭形，胞体小，胞核明显。s-100免疫组化观 察，细胞染色为棕黄色，核膜明显。3. 1. 1倒置显微镜观察2003年，丁文龙和汪洋⁷在体外培养的大鼠许旺 细胞神经生长因了和脑源性神经营养因了的表达实验中，在倒置相差 显微镜下观察活的许旺细胞绝大多数能牢固贴壁，细胞为梭形，少量 的为椭圆形或三角形，胞体饱满，立体感强，折光性好。经甲苯胺蓝

10、 染色的许旺细胞轮廓清晰，胞核呈紫蓝色，着色深而均匀。许旺细胞 平行排列或互相桥联，呈“手拉手”，“肩并眉”。3. 1. 2扫描电镜观察许旺细胞为橄榄形，突起呈圆索状伸展。胞体表面有颗粒状隆起, 亦可见绒毛样突起。细胞聚合在一起呈条索状，类似于体内排列形成 的 bunger 带。3. 1. 3激光扫描共聚焦显微镜检测方法主要观察许旺细胞在三维材料上的生长情况，用sabc-cy3染色, 染色的许旺细胞呈鲜红色、梭形，胞核不明显。3. 1. 4透射电镜观察许旺细胞中央最厚部厚度0002 mm,向两端逐渐变薄，细胞紧 密贴附牛:长，有时复层工长，许旺细胞细胞核扁长。核糖体丰富，内 质网分散，线粒体小

11、，分布于核周，高而基体明显，位于核周区。3. 2免疫学鉴定eglitis和mezey发现msc在某种特定条件下 表达胶质细胞标记物。s-100与gfap被公认为许旺细胞的标记物， 在周围神经损伤的修复实验研究中，hmscs经诱导后s-100与gfap 的免疫组化染色结果应都为阳性，从而说明转化后的细胞不仅从形态 学特征上呈现许旺细胞的外观，而且从功能学角度表达特定的蛋口产 物。许旺细胞的表面标志蛋白有神经胶质纤维酸性蛋白、s-100、ngf、 bdnf、p75受体等。3. 2. 1神经胶质纤维酸性蛋口 (gfap)鉴定2003 年，王剑等sup>8</sup>在成人骨髓基质干

12、细胞体外诱导为许旺细 胞的实验研究中通过对神经胶质纤维酸性蛋口 (gfap)的检测对许旺 细胞进行鉴定。gfap是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，是 许旺细胞表面的标志蛋口，其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状 态。3. 2. 2许旺细胞s-100、ngf、bdnf免疫组化鉴定2003年， 丁文龙和汪洋sup7 </sup>在体外培养的大鼠许旺细胞神经牛长 因子和脑源性神经营养因子的表达实验中对许旺细胞采取s-100、ngf、 bdnf免疫组化鉴定。s-100是存在于神经系统细胞胞浆内的一种酸性 钙结合蛋口，因其可溶于100%的硫酸溶液而得名，检测这种蛋白质 的存在，可作许旺细

13、胞鉴定之用。s-100免疫细胞反应阳性，ngf、 bdnf免疫细胞化学反应阳性的许旺细胞呈棕褐色。阳性反应的许旺 细胞以梭形为主、少量的为椭圆形或三角形，细胞边界清晰。4展望尽管本篇论述的很多实验技术都取得了较大进展，但是还有较多 和关问题需要给予解决，例如:实验屮转化后的许旺细胞在生存能力 与增殖能力方面是否发生改变？实验过程中是否导致表面标志蛋口 的变化或活性的变化？以上综述的mtt法，h3-胸腺u密睫核甘测定， dna受损程度的测定(单细胞凝胶电泳),显微分光光度和显微图像分 析许旺细胞的s-100蛋口表达量、单位面积内细胞分化数、突触生长 面积网化度的方法及许旺细胞的鉴定方法等等，对人

14、工神经支架上许 旺细胞生长活性做了综合性的初步体外评价，以便指导下一步人工神 经的制备及动物体内研究，并为人t神经半物材料的选择提供可能的 技术手段。参考文献1 casella gt,burge rp, wood pm. improved method for harvesting human schwann cells from mature peripheral nerve and expansion in vitro. clia, 1996, 17(4):327-3382 pauls j, nolte cf, et al. cultivation and expansion of car

15、ine schwann cells using reexplantation. berl munch tierarztl wochenschr, 2004, 117(7-8):341-3523 zhang zx, casey dm, julien jp,et al.normal dendrititic arborization in spinal motoneurons requires neurofilament subunit l. comp neurol, 2002, 450(2) : 144.4 yabe jt, wang f s,chylinski t,et al. selectiv

16、e accumulation of the h jigh molecular weight neurof' flament subunit within the distal region of growing axonal neurites.cell motil cytoskeleton, 2001, 50(1):1.5 henry jm. neuronsa ndn obelp rizes:ac entennial history of neuropathology. neuro surgery, 1998, 42 (1):143-156.6胡唏棠，熊良俭，劳杰从成年大白鼠坐骨神经分离培养许旺 细胞的方法学探讨中华显微外科杂志，2002, 25(3):197-200.7