魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定;开放性化学实验探索

1、第 26 卷第 3 期摇 摇 大学化学Vol. 26 No. 3摇摇 2011 年 6 月UNIVERSITY CHEMISTRYJun. 2011魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定开放性化学实验探索徐瑜摇 徐伟明摇 周晶(杭州师范大学材料与化学化工学院浙江杭州摇 310036)摇 摇 摘要摇 以魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定为例,为学生开设开放性实验,使学生巩固理论知识,激发学 习兴趣,提高实验操作技能,进一步提高科研创新能力和综合能力。摇 摇 关键词摇 开放性实验摇 魔芋摇 葡甘露聚糖摇 含量测定摇 摇 开放性实验1鄄2 可以使实验室教学资源得到充分利用,学生可以运用所学的化学知识,结合实际,

2、自 己设计课题,采用合作学习的方式解决问题。 开放性实验能使学生得到自主探索研究的机会,对于提高 学生综合素质、培养创新意识和实践能力很有意义。摇 摇 我们选择了一个有教学意义、难度适宜的课题魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定,作为开放性 化学实验,对我校化学类专业学生开设。 该实验涉及有机化学、高分子化学、分析化学、仪器分析等课程 知识以及实验操作的综合应用。1摇 课题背景知识介绍摇 摇 魔芋是一种草本植物,是我国的特产,广泛分布于长江流域。 魔芋球茎中含有葡甘露聚糖(KGM)、 淀粉、生物碱、纤维素和矿物质等营养成分,其中 KGM 是一种优良的低热量、低脂肪、高纤维素的水溶 性膳食纤维。 许多

3、研究表明,KGM 具有降血糖、降血脂及逆转脂肪肝、通便减肥、抗癌、增强免疫功能、 抗衰老等3 保健作用和医疗功效。 魔芋葡甘露聚糖有独特的理化性质和一些优良的特性,如强吸水性、可食用性、流变性、增稠性、凝胶性和成膜性,在制药工业、日用化学工业、造纸工业等领域有广泛的 应用。摇 摇 魔芋葡甘露聚糖是已知植物胶中黏度最大的天然高分子多糖,其分子式为( C6 H10 O6 ) n 。 对 KGM 化学结构研究的有关报道很多,但其确切结构至今尚无定论,奥山典生等人推测它的结构如图 1 所示。图 1摇 KGM 的推测结构5鄄6摇 第 3 期徐瑜等:魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定开放性化学实验探索592摇

4、 实验方案设计摇 摇 有多种用于评价魔芋精粉和相应产品质量的方法;KGM 含量是评价的关键指标。 KGM 含量的测 定方法有很多种,有费林滴定法、3,5鄄二硝基水杨酸法(DNS 法)、甘露糖胶重量法、苯酚比色法、旋转黏 度法、薄层色谱法、气相色谱法4 和高效液相色谱法,每种方法都有各自的优缺点。 根据这一情况,可 让学生查找相关文献,根据自己的知识水平和兴趣,选择一种或几种测定方法进行实验,并对实验结果 进行分析和比较;然后采用小组讨论的形式探讨是否可行;再由教师把关,逐一进行评价;最后制定出最 佳实验方案。 这一过程有助于开阔学生的思维,培养学生比较辨别的能力。 高年级的学生还可对所用测定方

5、法中不同因素对实验结果的作用和影响进行分析和评价。2. 1摇 实验前准备工作摇 摇 学生选择某种测定方法后,根据文献准备实验用化学药品、试剂和仪器,其中遇到如气相色谱仪、液相色谱仪、紫外可见分光光度计等大型仪器时,还需进一步学习和巩固这些仪器的实验原理和操作方 法。2. 2摇 样品的预处理摇 摇 样品的预处理即 KGM 的提取方法有好几种:酸性冷溶法、酶解法、沸水溶解法、乙醇沉淀法、超声 波提取法、甲酸鄄氢氧化钠缓冲液溶胀法等。 每种提取方法都有自己的优缺点,学生可以根据实验室条 件和实验时间选择感兴趣的方法。2. 3摇 实验操作摇 摇 选择好样品测定方法和预处理方式后进行实验操作。2. 3.

6、 1摇 3,5鄄二硝基水杨酸法( DNS 法)摇 摇 选择甲酸鄄氢氧化钠缓冲液溶胀法提取 KGM,制作标准葡萄糖工作液的曲线,确定最大吸收波长,制备 KGM 水解液,选择一定的显色时间、DNS 添加量、水解酸度和水解时间等因素进行检测,按下式算 出 KGM 的含量:摇摇摇摇w(KGM)= 着 伊(5T样 - T白)伊 50m摇 摇 式中 w(KGM)为 KGM 的质量分数( 下同);着 为甘露糖和葡萄糖在葡甘露聚糖分子中的残基分子 量与葡甘露聚糖水解后得到的甘露糖和葡萄糖相对分子质量之比;T样 为水解液的吸光度值;T白 为空白 样的吸光度值;m 为魔芋粉样品质量。2. 3. 2摇 高效液相色谱

7、法7摇摇选择超声波提取法来提取 KGM,制作含葡萄糖、甘露糖均为 0. 1mmol / L 标准混合液的工作曲线,制备 KGM 水解液,按标准曲线法进行操作,衍生化后采用反相高效液相色谱法,分段梯度洗脱,检测波长为 250nm,按下式计算 KGM 含量:摇摇摇 摇 w(KGM) =(mM+ mG )伊 14. 59m摇摇式中 mM 为样品中甘露糖质量;mG 为样品中葡萄糖质量;m 为样品魔芋精粉的质量。2. 3. 3摇 甘露糖腙重量法8摇 摇 选择酸性水解法提取 KGM,冷却后过滤,收集滤液,调节 pH 至 3. 0,加苯肼混合,室温条件下静置18 20h,用已干燥至恒重( m1 ) 的定量滤

8、纸过滤, 洗涤沉淀及滤纸, 将带有沉淀的滤纸烘干至恒重(m2 ),按下式计算 KGM 含量:60大学化学第 26 卷摇摇摇摇 摇 w(KGM) =m2- m1伊 1. 0351m摇摇式中 m 为样品质量;m1 为干燥滤纸质量;m2 为干燥沉淀和滤纸的总质量;1. 0351 为由甘露糖到葡甘聚糖的换算系数。2. 3. 4摇 苯酚比色法9摇摇选择乙醇沉淀法提取 KGM,绘制标准葡萄糖工作液的曲线,配制 KGM 样品液,加入 6. 0% 苯酚试剂,于冰水浴中加适量浓硫酸,冷却后于 490. 0nm 波长处测吸光度,按下式计算 KGM 含量:摇摇摇 摇 w(KGM) =着 伊 籽1籽2摇摇式中着 为多

9、糖的校正系数;籽1 为标准曲线上查得的样品质量浓度;籽2 为加入样品的质量浓度。2. 4摇结果分析摇 摇 通过上述实验操作,学生可以感受到整个科学研究的过程,对不同的测定方法得到的结果进行分析 和比较,总结出最佳的实验条件;还可进一步进行放大试验、精密度试验、重现性试验、回收率试验等,分 析误差产生的原因和操作的关键,总结经验。2. 4. 1摇 DNS 比色法摇 摇 DNS 比色法的测定原理是:魔芋葡甘露聚糖水解后生成甘露糖和葡萄糖两种还原糖,3,5鄄二硝基水 杨酸与还原糖共热后生成棕色的氨基化合物,在一定范围内,还原糖的量同反应液的颜色强度呈比例关 系,利用比色法可测定魔芋中葡甘露聚糖的含量

10、。摇 摇 在 KGM 的提取方法上要说明以下几点:1) 常规水提法的不足之处是魔芋粉水溶胀后,溶液较浑 浊,颗粒多且破碎不完全,导致 KGM 不能完全溶出,KGM 含量测定值偏低,提取时间长;2) 超声波提取 法利用超声波具有的机械振动能、热学性能和强大的空化效应,用超声波清洗器在除去魔芋精粉中的游 离还原糖后,超声提取魔芋精粉中的 KGM 并进行检测,与常规水提法相比,该方法提取时间缩短,提取 效率提高;3) 甲酸鄄氢氧化钠缓冲液溶胀法提取效率高,简单快速,结果可靠,省去了常规法、超声水提 法中用 85% 乙醇除去游离还原糖的操作,通过试样空白对照扣除,以独特的定容方法避免了转移过程 中容器

11、壁上附着 KMG,从而使结果更加准确,实验重现性高。摇 摇 DNS 比色法不需昂贵的大型分析仪器,操作简便,容易上手,但此法中氨基化合物的吸光度随时间 的变化而变化,必须使葡萄糖标准溶液的显色反应后存放时间与样品溶液的显色反应后存放时间一致, 以减少因显色反应后存放时间不同而造成的分析误差;另外此法不能得出 KGM 分子中甘露糖和葡萄 糖的物质的量比。2. 4. 2摇 高效液相色谱法摇 摇 高效液相色谱法首先测定标准混合液中甘露糖和葡萄糖这两种单糖间的校正因子,把样品中甘露 糖和葡萄糖的峰面积与内标物鼠李糖峰面积的比值分别代入各自的线性回归方程,求得各自的量,再经 计算得样品的 KGM 含量与

12、两种单糖的比例。摇 摇 该方法分离效率高,分析快速,定量准确,检测时间较短,准确度较高,能同时测定 KGM 含量及其 单糖组成。 但仪器昂贵,所需试剂比其他方法偏贵,实验操作较复杂。2. 4. 3摇 甘露糖腙重量法摇 摇 甘露糖腙重量法的原理是甘露糖与苯肼反应,生成甘露糖腙,而葡萄糖对甘露糖与苯肼反应没有影 响,甘露糖在葡甘露聚糖中以一定比例存在,只要葡甘露聚糖彻底水解,就可以准确测出甘露糖的含量, 通过换算能够得到 KGM 的含量。摇 第 3 期徐瑜等:魔芋精粉中葡甘露聚糖含量的测定开放性化学实验探索61摇 摇 此法不受淀粉、纤维素及其他可溶性糖的影响,没有溶胀及分离杂质的麻烦,但分析过程中

13、被分析 组分易损失,误差大。2. 4. 4摇 苯酚比色法摇 摇 苯酚比色法的测定原理是:先用 50% 乙醇浸泡,离心,除去单糖、双糖、低聚糖、苷类、生物碱等干扰 成分,然后用水提取其中所含的可溶性多糖,多糖类成分在浓硫酸作用下,水解生成单糖,再与苯酚缩合 生成黄色化合物,颜色深浅与糖的浓度成正比,从而可求得 KGM 含量。 此法与 DNS 比色法类似。摇 摇 该方法测定 KGM 含量简单快速,稳定性好,易操作,原料简单价廉,但操作要仔细,否则令结果偏 低,标准液和样品液的浓度需合理配制,吸光度需控制在一定范围内。2. 4. 5摇 开放性实验的实践与分析摇 摇 我们发现最初学生得到这个课题后根本

14、不知道该从哪里下手,只是像平时一样,期待教师把具体的 实验方案、实验步骤明明白白地写下来再进行实验。 经过指导教师讲解如何进行文献检索及如何确定 实验方案的演示,学生能逐渐进入到研究状态,自己寻找感兴趣的实验方法并进行实验,在此过程中发 现不理解的和有疑问的地方能主动探讨,学生的积极性和热情较高。摇 摇 在这个开放性实验过程中,我们发现学生最容易掌握甘露糖腙重量法,但初期实验结果误差较大; 对于 DNS 比色法和苯酚比色法,学生掌握的难易情况次之,主要是对试剂的预处理不够好,数据处理和 计算公式的推导不熟练;较难掌握的一种方法是高效液相色谱法,由于涉及到大型仪器高效液相色谱 仪,对实验原理的理

15、解和实验操作都有一定的困难。 学生采用这些方法进行实验的重点是要先准确掌 握各种实验方法的测定原理,这样在后面的实验操作中才能做到胸有成竹。摇 摇 通过开放性实验,学生不仅系统查阅文献的能力得到显著提高,而且通过对实验的多次重复,从实 验原理分析误差的来源,实验动手能力也大有提高;另外,在实验过程中,通过学习超声波清洗器、紫外 可见分光光度计、高效液相色谱仪等大型仪器的使用,培养了学生综合运用多门化学课程的相关知识的 能力;最后,同学之间还可以通过对实验结果和影响因素的分析、比较,在学会体会实验方法的多样性带 来乐趣的同时,掌握科学研究的严谨性。3摇 结语摇 摇 在实验过程中,可能会出现各种意外情况,教师要及时作必要的指导和调整。 开放性实验突出了学 生的主体地位,这种模式对提高学生的创新能力和综合能力是非常重要的。参摇 考摇 文摇 献1 摇 李文杰. 重庆工学院学报,2006,20(6):1572 摇 王润孝,李小聪. 中国高等教育,2005,9:373 摇 古元冬,史建勋,胡