重组TaqDNA聚合酶的表达和纯化鉴定

1、重组taqdna聚合酶的表达和纯化鉴定24 (5) : 124126江西农业学报2012,act aagriculturaejiangxi垂组taqdna聚合酶的表达和纯化鉴定刘钦松，刘孟刚，张从从，张程，许彤(山东博奥克生物科技有限公司，山东聊城252000)摘【h的】。【方法】耍：表达、纯化taqdna聚合酶，并检测其扩增性能活化含 taqdna聚介酶基因的菌株jm109,iptg诱导表达。h的蛋白利用akta蛋白纯化系统，ileparinsepharosefastflow, q sepha-依次过 affi gelbluesepharose, rosefastflow,。【结果】经 sd

2、s page 分析， 以国外进口 taq酶为标准，采用对比法初略测定酶活性，验证产品质量制备的tdqdwa聚 合酶具有扩增效率高、。【结论】纯度高、特异性强、无核酸酶污染、活性稳定等优点成 功表达纯化taqdna聚合酶，其扩增性能达到菇至超过国外同类产品。关键词:taqdna聚合酶；纯化;扩增性能中图分类号:q814. 1文献标识码：a文章编号:1001-8581 (2012) 05-0124-03expression, purificationandidentificationofrecombinanttaqdnapolyine:raseliuqinsong, liumeng gang, z

3、ilaxgcong cong, zhangcheng, xutong(shandongboaokobiotechnologylimitodcompany, liaochong252000, china)abstract： inordortocxpressandpurifytaqdnapolymoraso, anddetectitsamplificationpetfornumce,e. colistrainjm109containingthegeneoftaqdnapolymerasewasactivated, andthegenewasexpressedunderthe inducemenlo

4、fiptg. theexpressedhcparinsepharoscfastflowandprotcinwaspur i f i edbyaktapro te i npurificationsystem throughpassingaffigolbluosopharose,qsopharosefastflowinturn. takingtaqonzymcimportcdfroniabtoadqsthcstandatd, theenzymeactivitywasroughlydeter- andtheproductqualitywasverifiedfinally. theresuitsrev

5、ealedthatthepreparedmined throughant i thesesandsds pageanalysis,taqdnapolymerasehadthefollowinggoodcharacteristies：hi ghamplificat ionefficiency, highpuri ty, strongspecificity,nonucleasepollutionandstableactivity. inconclusion,thercconibinanttaqdnapolymorasewassuccessfullyexpressedandpurifiod, and

6、itsamplificationperfonnancecould:reachorexceedthatofthesimilarproductsimport edfromabroad.keywords： taqdnapolymerase； purification； amplificationperformancemullis 等1 1985 年提出聚合酶链式反应（polymerasepcr）, 1988 年 saiki 等2 从温泉的细菌chainreaction,thermusaquaticus中提収出耐热taqdna聚合酶，分子量为94kda,由832个氨基酸残 基组成，热稳定性好，在758

7、ctc条件下每个酶分子每秒钟可聚合约150个核昔酸，在 pcr实验中起着重要作用，被广泛应用于生物学、医学等领域2 4公司）,高速冷冻离心机（cr21ght, h本h立），超声波细胞粉碎机（jy92 iid,宁 波新芝），凝胶成像仪（biodoc it 体机，pcr仪（tc512,上海思们明），英国 techne） o氨节青霉素（ampicillin）抗生素购自amresco公yeastextrant购自oxotd公司， affi gel 司；tryptoneheparinsepharosefastflo qsepha-bluesepharose、rosefastflow购自ge公司;异丙基一

8、 b _d一硫代毗喃半乳糖昔（iptg）、聚乙烯亚胺 （pei）、硫酸钱（nh4） 2s04）、乙基苯基聚乙二醇（np40）、二硫苏糖吐温 （tween）均购自sigma公司，其他试剂醇（dtt）、均为分析纯。1. 3taqdna聚合酶的表达配制lb培养基4l,灭0. 1%活化，180r/min, 37菌，备用；取40mllb培养基，°c过夜培养；第2天进行1% 菌种扩大培养4l,待菌液0d为0. 60. 8时，加入iptg （终浓度0. lmmol/l）,诱离 心收集菌体，去上淸，称重20g,备用。导5h, 1. 4taqdna聚介酶纯化前处理用100ml的悬浮100mmol/lt

9、ris-iicl (pii8. 0) , 0. lmmol/ledta,液taqdna聚合酶由于thermusaquaticus培养因难,产量较低，虽然制备taqdna聚合酶的方法较多，但简便方法生产的酶制剂比活性不 高，并11质量上无法和国外进口 taqdnapolymerase相比，根本无法满足人们对高质量 taqdna聚合酶的需求5。木研究利用基因工把含有 thermusaquat icusdnapo 1 ymerase 程重组技术,基因的菌株成功发酵诱导，利用世界上先进的蛋白纯化系统进行纯化，得出高质量的 taqdna聚合酶。11. 11. 2材料与方法菌种含taqdna聚合酶基因的j

10、m109菌株取口主耍器材ge蛋门纯化系统(aktapurifieri0,山东博奥克生物科技有限公司研发中心菌种室。)5期刘钦松等：重组taqdna聚介酶的表达和纯化鉴定1250. lmmol/ldtt, 10%甘油于冰上重悬沉淀,超声波细12000r/胞粉碎机破碎细胞,然 后75°c热处理30min, min, 4°c离心20min,弃沉淀上清备用;于冰上慢慢加入5%的 pei2. 7ml, 12000r/min, 4°c离并搅拌40min, 12000心,取上清,并缓慢加入30g(nii4) 2s04,搅拌 lh, 4°c离心；沉淀用 30ml 含有

11、50mmol/lnacl 的 r/min,tedg 溶液 e50mmol/ltris-hcl (pii8. 0)、0. 5mmol/ledta、0. lmmol/ldtt、10%甘 油溶解。1. 5taqdna聚合酶纯化聚合酶依次过affigelbluesepharose> iieparinsepharosefastflov qsepha-rosefastflow,期间分别用下 个胶的平衡溶液透析 12h, 50mmol/ltrishc1 (ph 最后用 taqstoragebuffer 0. lmmol/ledta、 0. lmmol/ldtt 50mmol/l8. 0)、kck 0.

12、 5%np40、1%吐温、50%甘油透析，一70°c保存。1. 6taqdna聚合酶的验证分别对taqdna聚介酶进行活性以及核酸酶污染的测足。情况，结果如图3所示，加入本酶反应后，x dna/hindhi没冇发牛弥散且亮度没冇明显 变化，因此，本制品未发现核酸外切酶污染。1： 50u上样量；2： 25u上样量；3： 5u上样量；4： 2. 5u上样量；m： proteinmarker图2taqdna聚合酶不同上样量sds-page电泳结果22. 1结果taqdna聚合酶活性的测泄利用分离纯化的重组taqdna聚合酶与国外进口的taqdna聚合酶同活1%力同时进行pcr扩增，结果如图

13、1 所示(上样5 p l, agarosegel),本研究制备的taqdna聚合酶与国外进都可扩增目的 dna片段，口 dna聚介酶有相似的活性，亮度基本一致1： x -dna/hindiii （阴性对照）；2、3： x -dna/hindiii外切酶污染验证产物图3核酸外切酶污染检测结果2. 4核酸内切酶检测10u的木酶和1 u g超螺旋质粒45、70°c分别反应4h,在22、观察dna电泳谱带变化情况，结果如图4所示，加入本 酶反应后，超螺旋质粒没有故本制品未发现核酸内切酶污染。出现降解弥散，2. 5m： dl5000dnamarker； 1> 3、5、7：国外a公司进口

14、taq酶pcr产物（阴性对照、 0. 5u、1u、2u） ； 2、4、6、8：生产 taq 酶的 pcr 产物（阴性 0. 5u、1u、2u）对照、taq dna聚介酶的稳足性配制本酶并分别放到-20°c保存，不同的管中,每5d取出1支放到室温（25°c）条件下,30d后进行pcr, 50ulpcr体系中均加入2u本酶，查看条带亮度变化情况，如图5,室温放置30dtaq酶仍 具有较高活力，后，基木没有变化。图itaqdna聚合酶pcr扩增效率电泳图2. 2taqdna聚合酶纯度检测sds-page电泳检3讨论利用大肠杆菌系统对目的蛋口进行表达，有其无法5、25、50u分别上

15、样，测木制品纯度，取木制品2. 5、电泳结果如图2所示。用gel- proanalyzer软件分析图谱，结杲显示纯化生产的tagdna聚合酶无明显杂带，纯度达到 95%以上。2.m123423mul/d分别反应iii在观察电泳谱带变化优点比拟的优越性，例如培养周期短，表达水平高，成本低等6o taqdna聚合酶在分子生物学小应用广泛，有关taqdna聚合酶的制备技术也一直在不断的优化，主7 11 o、，江西农业学报24卷术，通过akta蛋白纯化系统分离纯化taqdna聚介酶，通过多次严格的验证，该dna聚 合酶具有活性稳定、纯度高、扩增效率高、特异性强、无核酸酶污染等优点剂市场较为混乱，价格普

16、遍偏低，应用akta蛋白纯化系统虽然能得到高质量的产品， 但是成本较高，利润空间较小，因此，以后应加人纯化替代品的研究，在保证产品质降低 生产成本，达到双赢的l1的。量的基础上，参考文献：1 mulliskf, faloonaf, scharfs, etal. specificenzymaticampl ifi- coldcationofdnainvitro： thepolymerasechainreaction j 1986, 51(1)： 263 273. springharborsympquantbio1,2 saikirk, gelfanddh, stoffels, etal. pri

17、merdirectedenzy-nuiticampl i f icationofdnawi thathermostabl ednapolymer-ase j . sci ence, 1988, 239 (4839) : 487-491.3 chiena, edgardb, trelajm, etal. deoxyribonucleicacidpoly- merasefromtheextremethermophi1ethermusaquaticus j . jour-nalofbacteriology, 1976, 127： 1550-1557.4 josephsambrook, davidwi

18、11iamrusse1l molecularcloning： ala-m newyork： coldspringllarbolboratorymanual (volume3) 1、2：内切酶污染验证产物；3： lug超螺旋质粒(阴性对照)；m： dl5000dnamarker2001: 699 701. laboratorypress,5 肖朝文,j 杜娟,李晚忱.taqdna聚合酶制备技术的优化2004, 22 (4) : 318-321.四川农业大学学报,6 谢伟，乐超银，王健，等.重组人粒细胞集落刺激凶子在人肠杆中国组织工程研究与临床康复，2008, 12菌中的表达j (46) : 91

19、81-9183.7 汪靖超，李荣贵.重组taqdna聚合酶在大肠杆菌中的表达与j青岛人学学报：工程技术版，2004, 19 (1) ： 93-96.纯化8 孙亮先，黄周英，谢进金，等.快速纯化高活力基因工程taqdna 聚合酶j.泉州师范学院学报,2001, 19 (4) : 64-66.9 dingyii,liust, qiqy. preparationoftaqdnapolymerase.agriculturalscience&techno1ogy, bytherma1purification j图4234567m核酸内切酶污染度检测结果1：室温放置0d； 2：室温放置5d； 3：室温放置10d； 4：室温放置15d； 5：室温放置 20d； 6：室温放置 25d； 7：室温放置 30d； m： dl5000dnamarker2011, 12 (3) : 375-378.10何钢，王义强，李樊，等.大肠杆菌表达重组taqdna聚合酶j.中南林学院学报，2006, 26 (5) : 50-54.的分离和纯化11葛银林，邹承淑，闫梅英，等.大肠杆菌表达耐热dna