NK细胞的生物学及在肿瘤治疗中的作用

1、综述nk细胞的生物学及在肿瘤治疗屮的作用口然杀伤细胞(natural killer cell, nk细胞)是一种骨髓衍化的淋巴细胞，由于在形态 上胞浆丰富，胞质内含有人型嗜犬青颗粒，故乂称为人颗粒淋巴细胞(large granular lymphocyte, lgl) w 1971年cudkowizc和bennett首次描述了这类细胞的功能，他们 发现经放射线照射的小鼠接受母体来源的骨筋细胞移植后发生了排斥反应"1。传统理论认 为，移植抗原是共显性遗传的，例如，亲代抗原在第一代杂种共表达，子代能够耐受亲代的 主要组织相容性复合体(major histocompatibility co

2、mplex, mhc)。然而,cudkowizc 和 bennett发现h-2基因杂合体的第一代杂种鼠经放射线照射后能够排斥亲代h2基因纯合体 小鼠的骨髓细胞。这种现象被称为“杂交抵抗”。厉来发现介导这种现象的细胞是一种淋巴 样细胞，对放射线不敏感，能在体外直接杀伤肿瘤细胞，且无mhc限制性1>71o随斤就将 这类细胞命名为nk细胞。与t、b细胞免疫激活过程不同，nk细胞的免疫反应是迅速的， 意味着其町在感染最初阶段清除病原体。事实上，众多研究已表明，nk细胞可以清除胞内 菌和寄生虫感染，在控制一些病毒感染的过程中也起重要作用尽管一些体内外试验表 明，nk细胞具有抗肿瘤活性，但是其确切机

3、制还不完全清楚12'14o1. nk细胞的生物学特征nk细胞占外周血淋巴细胞的10-15%,也存在于脾脏、骨髓及其它组织，包括肝脏、 腹腔、胎盘。nk细胞在肿瘤和病毒感染中发挥很重耍的免疫监视作用，构成机体免疫系 统第一道防线。与免疫系统其它细胞(尤其是t细胞)不同，nk细胞不能被抗原重复刺激 致敏而且没有长期的抗原记忆功能。nk细胞缺乏特异性的细胞表而分子标志，许多标志认 为是nk相对特异性的，比如小鼠nk细胞表而的nkl.l、dx5、asgm1,人类nk细胞 表面的cd56, cd161j5-18o但是这些表面分子在某些t细胞亚群和其它类型细胞也冇表达。 因此，nk细胞被定义为表达

4、上述分子标，忐，同时不表达t细胞特异性标志如cd3、cd4, 也不衣达特异性的抗原识别受体(tcr或bcr)。作为一种先天性免疫分子，nk细胞 无需识别经典的mhc分子，其发挥细胞毒效应主要通过释放穿孔素/颗粒酶途径，也可以 通过fas配体(fasl)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, trail)杀伤靶细胞“刃。nk细胞活化后还可以分泌多种细胞因 子，包括 y 干扰素(gamma interferon , ifn-y)> 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor

5、 , tnf)> 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor , gm-csf)> 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor , g-csf)等*20-22。 这些细胞因子可以抑制或促进造血作用，参与病毒感染后的早期免疫应答和迟发性t细胞 介导的免疫应答。在nk细胞自身的发育、分化中，一些细胞因子发挥着重要的作用。白介 素(interleukin, il)2、il15、il-21三种细胞因子共享il2受体(il-2r) 丫链，能够诱 导nk细胞活化

6、和增殖，然而只有il-15在nk细胞的发育过程屮起关键作用第26。与il-2 缺陷鼠不同，在il15基因敲除鼠中缺乏功能性的成熟nk细胞rm。将成熟nk细胞输注 il-15基因敲除鼠中仅能存活数天，而输注正常小鼠却能长时间存活，证明il-15为nk细 胞提供了关键性的生存信号"i。与t细胞在胸腺中发育不同，骨髄是nk细胞发育的场所 23/29。这并不意味nk细胞和t细胞在分化上完全独立，已有研究表明，胸腺中存在nk/t 细胞的共同前体细胞，提示nk细胞和t细胞为个休发育上关系十分接近的两类细胞则。 另外，细胞因子也可调节nk细胞的功能。ilj2和ifn-a/p能对nk细胞发挥有效的刺

7、激 效应，联合应用il-12和il18能显著提升nk细胞的功能血31】。nk细胞活化过程中il-2 也起重要作用z2】。2. “丢失口我”假说1985年，ljunggrcn和karrc发现，与mhc依赖性的t细胞免疫反应不同，nk细胞 可以杀死不表达mhc-i类分子的肿瘤细胞，进而提出“丢失自我”假说列。该假说认为， 细胞免疫应答中t细胞和nk细胞是相互补充的两个方面:初始t细胞表面的tcr与靶细 胞表面的抗原肽:mhc分子复合物特杲结合后被活化；相反，nk细胞能杀伤不表达mhci 类分子的靶细胞，一旦识别mhc-i类分子就产生杀伤抑制性信号列。研究者发现，一种不 表达鼠mhc分子h2的鼠白血

8、病细胞易被nk细胞杀死，而正常表达h2的白血病细胞则 不能被nk细胞杀死国】。同时也发现人nk细胞可以清除不表达mhc-i类分子的类淋巴母 细胞系网。冇趣的是，h2缺陷鼠白血病细胞转染了 h2基因，或者人白细胞抗原(human leukocyte antigen, hla) -1缺陷的类淋巴母细胞转染了 hla-1基因后，又分别恢复了对 nk细胞的杀伤不敏感性迢3久但是，“丢失自我”假说不能解释所有现象，并非所有表达mhc-i类分子的细胞可以避 免nk细胞的杀伤，nk细胞也不能杀伤所mhc-i缺陷的细胞。有研究表明，nk细胞不 能排斥mhc-i缺陷的非造血系统组织，如皮肤移植物。该研究应用一种

9、突变鼠，该鼠由于 卩2微球蛋白基因突变不能表达止常卩2微球蛋白，不能形成mhc-i类分子的轻链，故缺乏功 能性mhc-i类分子的衣达，nk细胞不能有效排斥该突变鼠来源的皮肤移植物冏。另有研 究表明，自体nk细胞可以杀死一些表达mhc-i的病毒感染细胞，并且经il2活化厉，还 可以杀死一些nk细胞不敏感的靶细胞39'40jo因而，“丢失自我”假说仅仅是nk细胞识别 靶细胞一种解释。3. nk细胞受体nk细胞能杀伤肿瘤细胞和病毒感染靶细胞，对止常口身细胞无细胞毒作用，表明它们 一定具冇能够识别正常自身组织细胞和异常体内组织细胞的能力。研究发现，nk细胞表面 具有两种不同的受体，分别是活化和

10、抑制性受体。nk细胞通过表面活化受体与自少组织细 胞、病毒感染细胞和某些肿瘤细胞表面相应糖类配体结合，可经活化信号转导途径，产生杀 伤作用；通过表面杀伤抑制受体与细胞表面mhc-i类分子结合，nj产牛杀伤抑制信号，抑 制其杀伤功能。因而，nk细胞受这两种受休的调控，正常情况下处于一种平衡状态，当一 些因素破坏了这种平衡，使活化或抑制性受体占主导地位，则nk细胞分别产生杀伤或杀伤 抑制作用。3.1 nk细胞抑制性受体笫一类抑制性受体首先在啮齿类动物中发现，名为ly49受体，可直接与经典的mhci 类分子结合鏡判。在b6鼠体内发现超过10种不同的ly49受休,其中有8利】是抑制性的抄迅 在人体内仅

11、发现一种类似ly49的无功能性的基因片段ma。第二类是杀伤细胞免疫球蛋白 样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor, kir)家族，仅在灵长类动物中出现，啮齿 类动物中没有，也能直接与经典的mhc-i类分子结合冬叫大多数人体内存在10种不同的 kir基因，且并不全都是抑制性的一64】。第三类在灵长类和啮齿类动物中均存在，由 cd94/nkg2界二聚体构成65'68o 一些nkg2亚型能共享cd94的一段链，但仅有 cd94/nkg2a是抑制性的。cd94/nkg2受体能识别经典mhc-i类分子先导序列，这种先导 序列先与非经典mhc-i类

12、分子(包括hla-e分子和鼠qal分子)结介后形成复介物，再与 抑制性受体cd94/nkg2a相结合聊"。这种直接或间接识別经典i类分子的方式可能在抑制 nk细胞功能方面互为补充(图1)。但是并非所有经典i类分子包含这种先导序列，能够被 hla-e/qa-1识别，也并非所有经典i类分子能百接被kir/ly49识别陶习。这些抑制性受体一个非常重要的特征，就是在nk细胞亚群表而共表达或部分共表达， 细胞表而表达多种受体构成了 nk细胞独特的受体库。这种受体表达的多变模式允许nk细 胞能识別表达不同mhc-i类分子的细胞。例如，下调自身mhc-i类分子的宿主细胞能被 nk细胞识別杀伤，如果

13、完全缺乏mhc-i类分子的表达，则nk细胞的杀伤作用更加明显。对肿痫细胞和病毒感染细胞的研究也证实了这一点，因为它们部分或全部缺乏mhc-i类分 子的表达5这三类受体通过胞浆区的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs, itim)转导信号，可活化shp磷酸酶，抑制酪氨酸磷酸化，传递抑制性信 号76-78indirect recognitionhumancd94/ nkg2acd94/ nkg2amousenkdirect recognitionhumanly49mousenkhla-e|mhc、class laj(

14、h2)diverse peptidesclass /a 令 leader peptidesignal peptidasemhc class laprecursor图1： nk细胞能直接或间接识别经典mhc-i类分子。3.2 nk细胞活化性受体多年以来，对nk细胞活化受体的认识一直落厉于抑制性受体，在此期间，认为一些粘 附分子或共刺激分子，如淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte function associated antigen, lfa) -1,与nk细胞的活化冇关el。直到最近，陆续发现了一些与nk细胞活化冇关的受 体，才真止关注nk细胞发挥天然杀伤作用过程中的分子机制。nkp46

15、, nkp30, and nkp44代表第一类活化性受体，它们属于免疫球蛋白超家族，统称为天 然细胞毒性受体(natural cytotoxicity receptors, ncr)阿。其中nkp46和nkp30在静止的和 活化性nk细胞表面衣达，nkp44仅在活化性nk细胞衣面衣达銅。单克隆抗体(monoclonal antibodies, mabs)封闭ncr后可不同程度的阻断nk细胞杀伤多种肿瘤细胞的能力,如果同 时封闭这三种ncr,某些肿瘤能完全逃避nk细胞的识別杀伤作用wl。nkp46是ncr屮唯一 与人nk细胞杀伤鼠源性靶细胞过程相关的受体，相应地在鼠体内检测到nkp46的类似物。

16、 ncr与转导衔接蛋白的不同信号分子相互配对，包括cd3©、fceriy、karap/dap12f85871onkg2d是另一类nk细胞表而活化受体，属于nkg2家族成员，可识别非经典的mhc i 类相关基因(mhc class i chain, mic),包括 mic-a 和 micb蹈。mica 和 micb 不表 达卩2微球蛋白，在应激状态下可上调表达，fl多表达于上皮件肿瘤细胞表面，包括乳腺、 卵巢、结肠、肾、肺癌等组织阿叫 近來研究表明，ulbp (ul16-binding protein, ul16结 合蛋口)是nkg2d的另一种配体旳。这两种配体都存在于人类细胞农面，n

17、kg2d述对以 识别另一种存在于鼠类细胞表而的配体rae1 (retinoic acid early inducible 1),正常情况下, b6鼠可排斥表达rae-1抗原的肿瘤细胞rma, 一旦用抗nk1.1单抗清除鼠体内nk细胞 后，则不能排斥表达rae1抗原的rma细胞阿。与nkg2家族其它成员不同，nkg2d不 与cd94形成并二聚体结构，与nkg2a、nkg2c、nkg2e相比并没有更多的同源性区域 结合于cd94193o另外一些活化性受体，包括kir家族中的kir2ds和kir3ds, nkg2家族中的nkg2c、 nkg2e, ly49家族中的ly49d和ly49h,这些受体均能

18、识别mhc-i类的配体65>94_981o还 有一些所谓的复合型受休，如2b4和nkpso,与其它触发性受体结合后能诱导nk细胞杀 伤靶细胞的能力阿。4. nk细胞的抗肿瘤作用：nk细胞可以浸润到肿瘤局部，阻止肿瘤的扩散。例如nk细胞浸润与早期胃癌、减少 转移和淋巴浸润相关】。尽管有以上的和关作用，也有很多关于体外和动物试验的相关文 献报导，nk细胞在临床上的治疗作用仍然有待进一步研究。这些临床前期研究是大量止在 进行或已经完成的临床实验的理论基础，肿瘤动物模型试验己经被广泛用来研究nk细胞的 抗肿瘤活性。例如，divino等发现，以腺病毒为载体，转染il-12基因到乳腺癌肝转移小鼠 模

19、型体内，可显著提高纶存率，其中40%出现肿瘤完全消退逆2】。应用单抗清除体内nk细 胞，此抗肿瘤作用消失，il12被认为可能是促进了 nk细胞介导的细胞毒性及ifn-y的分 泌。最近研究发现nk细胞的功能与其定居部位对能存在一定的关系，如肝脏的nk细胞町 以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail),而外周血和脾脏nk细胞不表达trailo 目前认为trail是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(tnf)家族，可以诱导很多界常细 胞的凋亡，但是不能诱导正常细胞凋亡。ifn*缺陷鼠的肝脏nk细胞不表达trail,而 trail与控制肿瘤细胞(表达能结合trail的特异性受体)肝转移密切相关卩四。

20、一些研究显示，nk细胞町能与其它免疫效应细胞和分子互相影响发挥十分复杂的抗肿 瘤作用。tanaka等研究了 il-18在减小荷瘤鼠肿瘤体积过程中的可能作用机制，他们发现， 清除nk细胞,il-18的此种作用消失何。他们将il18、nk细胞、骨髓来源的树突状细 胞、初始t细胞、肝癌细胞体外共培养，研究nk细胞在免疫反应中的作用机制。结果发 现，il-18可以刺激nk细胞杀伤肿瘤细胞的作用，同时诱导了细胞毒性t细胞(cytotoxic t lymphocytes, ctl)。肿瘤特并性ctl的诱导作用依赖于il18,且与nk细胞和树突状细 胞和互接触密切和关。因此认为，树突状细胞和nk细胞的相互作

21、用可能促进了体内免疫记 忆的功能。免疫治疗作为一种方法应用于肿瘤病人，应考虑到患者机体免疫系统的完整性问题。例 如，cd3是nk细胞和t细胞中转导跨膜信号的成员么一，肿瘤患者及荷瘤鼠体内cd3© 农达量卜降，05-,08o肿瘤化疗是通过氏接抑制免疫效应细胞功能或分泌细胞因子來最大限度 的抑制免疫反应，但是nk细胞抗肿瘤作用的某些机制可能是特异性的。人黑色素瘤细胞分 泌巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration.inhibitory factor, mif)，可以直接抑制nk 细胞的杀伤毒性。在慢性粒细胞白血病(chronic myelogeneous leukem

22、ia, cml)研究方面, -些实验室报导随疾病进展伴随nk细胞功能降低和细胞数量的减少,09-,2o bcr/abl基 因产物百接影响了 nk细胞的分化叭 以上结果也许对以解释cml患者白休骨髓移植后， 应用il-2和活化nk细胞，疗效其微。有少数资料认为nk细胞抑制性受体与肿瘤形成有关，但这方面研究的困难在于nk细 胞受体表达与mhc-i类分子没冇直接关联。在临床上应用单倍体干细胞移植的病人中，供 者nk细胞的kir与受者mhc-i类抗原不匹配，可引起移植排斥反应铁由于nk细胞表 面受休类型的多样性，真止了解nk细胞的抗肿瘤机制尚有待于对所有受休一配体的研究和 供者一受者之间nk细胞受体类

23、型的分析。koh等报导了更多关于nk细胞抑制性受体与肿瘤形成相关的实验资料讥 在小鼠模 型上,5e6抗体的f(ab )2片段可以封闭nk细胞抑制性受体,如ly49c和ly49i。5e6+nk 细胞占小鼠nk细胞总数的35-60%,体外实验表明，rht c1498白血病细胞和el4淋巴瘤 细胞表达ly49c/i特异性配体h2b,对5e6 nk细胞的杀伤作用不敏感，但是如果特异性阻 断nk细胞表面ly49c/i受体表达，则可明显提高nk细胞的杀伤活性。向小鼠输注c1498 细胞后全部死亡，肝脏、骨齟、中枢神经系统都冇肿瘤细胞累及，应用含f(ab)2片段的5e6 抗体封闭ly49c/i受体后治疗组存

24、活率显著性增加，接种后120天，有1/4小鼠没有肿瘤形 成。这个实验第一次发现封闭nk细胞抑制性受体对以发挥nk细胞体内抗肿瘤的效应，为 临床上应用nk细胞治疗疾病开拓了 个新的可能途径。nk细胞可直接参与杀伤细胞作用，但是关于nk细胞在体内的重要牛理功能还不清楚， 可能与其分泌的细胞因子冇关。在一定的刺激下，nk细胞可以分泌较高浓度的tnf和 ifn-y,l6_l,9o il-12 通过激活信号传导子及转录激活因子 4 (signal transducer and activator of transcription factor 4 ,stat4)途径促进 ifn* 分泌120o il-1

25、8 通过 il-1 受休相关蛋口 (il-1 rrp)也能促进ifny分泌，敲除il1 r卬基因的小鼠对il-18无应答反应，同时其体内的 nk细胞也不表现杀伤和ifn-y分泌活性卩2】。给小鼠联介应用il-12和ilj8可导致ifn-y 介导的致命性炎症反应，但是在清除小鼠体内nk细胞或对stat4缺陷小鼠联合应用il-12 和il-18,则这一致炎作用就消失了血2】。nk细胞分泌的ifn和其它细胞因子在杀伤肿瘤细胞方面可能发挥了很大的作用。用一 种持续表达fas受体但是对于fas介导的体外杀伤活性不敏感的肾细胞癌细胞系输注小鼠体 内，观察到ifn-y依赖性的肿瘤延迟生长和存活时间延长说3】

26、。细胞因子可以通过这种方 式影响肿瘤细胞归巢和细胞毒fko il-12和il-2可诱导nk细胞向肝脏聚集，但是在ifn-y 基因缺陷小鼠或用抗体封闭血管细胞粘附分子1 ( vascular cell adhesion molecule-1 , vcam-1)后，这种nk细胞的趋化作用消失】。因此研究这些复朵的细胞因子间的相互 作用及最近发现的趋化因子对nk细胞的趋化作用，将有助于了解如何操纵体内nk细胞的 作用125,126。应用活化nk细胞治疗肿瘤可追溯到上世纪80年代，早期的临床试验着重于晚期转移 性实体瘤的病人。在1l-2单用或联合活化的nk细胞治疗的病例中，虽然有20-30%jx应率， 仍然认为对大部分肿瘤的整体临床疗效不理想。也有资料衣明，肿瘤病人皮卜注射il2激 活内源性nk细胞的活性是安全可行的一种治疗方案,27-1301o美国学者发现向自体移植厉的 病人皮下注射il2扩增体内nk细胞后，病情得到缓解。id前的观点认为低剂量il2可以 促进骨髄前体细胞分化为nk细胞及il-2依赖性的nk细胞寿命延长但是进一步研