中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

1、    中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析    刘巧英+李梦歌+刘雪飞+余昊+王运兵摘要：采用兼并引物和race的技术，在中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）中获得丝氨酸蛋白酶的全长cdna序列，将该基因命名为asjsp，cdna全长为958 bp，开放阅读框为885 bp，推测编码295个氨基酸，预计分子量为31.20 kda，等电点pi为9.38，预测分子式为c1 374h2 222n390o407s15，不稳定系数为31.94，总亲水性系数为0.114，为疏水性稳定蛋白质。序列分析表明asjsp与其他盲蝽

2、科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性为55.70%。关键词：中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）；丝氨酸蛋白酶；rt-pcr；序列分析：s433.3 ：a ：0439-8114（2016）21-5659-05doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.21.056cloning and sequence analysis of serine proteinase of adelphocoris suturalis jakovlevliu qiao-ying， li meng-ge， liu xue-fei， yu hao， w

3、ang yun-bing（school of resourse and environment science，henan institute of science and techology，xinxiang 453003，henan，china）abstract： rt-pcr with degenerate primers and race were used to amplify partial cdna fragments and full cdna，one serine protease gene from adelphocoris suturalis jakovlev was i

4、dentified， designated asjsp. the full-length cdnas of asjsp is 958 bp，this gene contains 885 bp open-reading frames（orf） which encodes a putative 295 amino acid protein，with a predicted molecular mass of 31.20 kda and isoeletric point（pi） of 9.38. its predicted molecular formula is c1 374h2 222n390o

5、407s15. bioinformatical analysis showed that it is a instability index is 31.94 and the gravy 0.114，suggesting that it is a stable hydrophobic protein. sequences analysis showed that asjsp had 55.70% identity with complete serine protease genes from other miridae insects.key words：adelphocoris sutur

6、alis jakovlev；serine proteinase；rt-pcr；sequence analysis絲氨酸蛋白酶主要消化昆虫食物中的蛋白质类营养物质，并参与合成与降解昆虫体内的蛋白质，是大多数昆虫消化系统内较为重要的消化酶，其主要包含弹性蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等1-5。目前，已有一些关于半翅目盲蝽科昆虫的丝氨酸蛋白酶方面报道，研究发现lygus rugulipennis和creontiades dilutus等盲蝽科昆虫唾液中富含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类6-9，豆荚盲蝽lygus hesperus唾液腺内的总蛋白酶活性也以胰蛋白酶活性为主10-12。zhu等13发现美国牧草

7、盲蝽取食后，主要依靠其唾液腺内的丝氨酸蛋白酶先进行初步消化，之后其他肠道内的蛋白酶进一步消化，吸收蛋白质类营养物质，且丝氨酸蛋白酶的活性占其唾液腺内总蛋白酶活性的80%。以上研究结果说明，在半翅目昆虫消化系统内丝氨酸蛋白酶是较重要的消化酶。中黑盲蝽（adelphocoris suturalis jakovlev）为半翅目盲蝽科昆虫，是中国一种重要的盲蝽类害虫，广泛分布于长江流域和黄河流域14。中黑盲蝽的寄主植物种类众多，已报道有100余种，包括棉花等多种作物15。20世纪90年代末，由于农业产业结构调整以及bt棉花广泛种植减少化学农药的使用等原因，中黑盲蝽种群数量上升、为害加重，成为中国棉花等

8、作物的主要害虫16-19。由于其食性杂、天敌控制作用弱、寄主广泛及行动敏捷等特点，在作物大面积生产时增加了一定的防控测报难度。虽然，在一些半翅目盲蝽科植食性昆虫种类上，针对丝氨酸蛋白酶类消化酶已进行了分子生物学方面的研究，如豆荚盲蝽lygus hesperus及美国牧草盲蝽，但是目前关于中黑盲蝽的研究国内鲜见报道。本研究采用rt-pcr和race技术，克隆中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因的cdna序列asjsp，并对其进行初步分析，以期为中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶的分子消化机制奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料供试虫源：中黑盲蝽成虫采自河南省新乡县，采回后在实验室用新鲜四季豆人工饲养，室内温度条件（2

9、6±0.5） ，相对湿度60%70%，光周期168 h（ld）。饲养密度为4060头/盒，供试所用昆虫为羽化后的中黑盲蝽成虫。 1.2 试剂和仪器主要试剂：rna提取试剂盒（reeasy mini kit）购自qiagen公司。cdna第一链合成试剂盒（primerscript 1st strand cdna synthesis kit）购自宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒（gel extraction kit）购自omega公司。marker 、marker 购自tiangen公司。depc购自上海索莱宝科技有限公司。50×tae缓冲液购自上海双螺旋生物科技有限公司。其他

10、所用化学试剂为国产分析纯。仪器：neofuge 13r型高速台式冷冻离心机；tgradient型梯度pcr仪；jy600c型君仪电泳仪和jy-sp-bt型电泳槽；tanon3500型tanon凝胶成像系统；skanit re for multiskan go 3.2型全波长酶标仪；eppendorf移液枪；pyx-300q-a型智能光照培养箱；jj-cj-1fd型超净工作台。1.3 试验方法1.3.1 中黑盲蝽总rna的提取 将实验室饲养的中黑盲蝽成虫置于1.5 ml预冷的离心管中，加适量液氮研磨至粉末，按照rna提取试剂盒（reeasy mini kit）的具体方法提取中黑盲蝽总rna。1.

11、3.2 中间片段的获取 cdna的第一链合成按试剂盒（primerscript 1st strand cdna synthesis kit）说明书进行。pcr反应体系包括depc-treat water 34.75 l，10×pcr buffer 5 l，10 mmol/l dntps 4 l，正向引物2 l，反向引物2 l，cdna 2 l，taq酶0.25 l。pcr反应热循环参数：预变性94 3 min；94 变性 30 s，54 退火40 s，72 延伸10 min，34个循环；72 延伸10 min。正向引物序列：5-tcgtccaagccgactcat-3。反向引物序列：

12、5-acgcagatagcagcaca-3。1.3.3 全長cdna的获取 3端cdna扩增：反应采用3race system for rapid amplification of cdna ends（invitrogen）推荐的方法进行， 以总rna为模板，反转录酶合成cdna。再以反转录产物为模板，用引物5-gcctcttccatcaacttcaac-3与通用引物uap配对扩增3端。pcr产物稀释100倍作为模板，用上游引物5-agaactctgactgtttgtccg-3与下游引物uap进行第二次pcr，扩增产物回收、测序。5端cdna 扩增：按照5race system for rap

13、id amplification of cdna ends（version 2.0）推荐方法进行，以总rna为模板，用引物5-caagggtgtatctgttg-3，在反转录酶催化下合成cdna。转录产物经s.n.a.p纯化后进行tdt 加尾。最后，以加尾产物为模板，用引物5-ggtggtgtcaagtttctttgg-3与通用引物aap进行5端扩增。1.3.4 pcr产物的回收与序列测定 pcr扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并保存结果，切割目的条带按照凝胶回收试剂盒（gel extraction kit）的方法回收pcr产物，并于-20 保存回收目的产物。最后，将

14、纯化后的pcr产物送生工生物工程有限公司进行测序。1.4 数据分析采用blast获得的全长cdna序列，使用clustalx1.8 软件对这些序列进行比对。采用软件mega4.0进行kimura双参数遗传距离分析，构建nj进化树，bootstrap估算重复1 000次，检验分子系统树各处的置信度。利用tmpred软件（http：//software/tmpred_form.html）预测跨膜结构；采用expasy生物信息学资源网站的protparam工具（http：//protparam/）分析基本理化性质及protscale工具（

15、http：//tools/protscale.html）分析疏水性；使用signalp工具（http：/www.cbs.dtu.dk/services/signalp/）预测信号肽。2 结果与分析2.1 总rna的提取及测序结果通过检测，提取的中黑盲蝽成虫rna的od260 nm/od280 nm值为1.926，当od260 nm/od280 nm>1.8时，说明样品纯度较高，可以满足后续试验的要求。经测序，得到中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶cdna基因，命名为asjsp，长度为958 bp，推测其开放阅读框为885 bp，编码295个氨基酸，以atg为起始密码子，以ta

16、g为终止密码，结果如图1所示。2.2 序列同源性分析由图2可知，中黑盲蝽asjsp与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的蛋白序列的一致性为55.70%。asjsp与creontiades dilutus（登录号：aal15154.1）的一致性为84.41%；与绿盲蝽apolygus lucorum（登录号：afx73399.1）的一致性为32.93%；与其他盲蝽科的丝氨酸蛋白酶蛋白序列的一致性均大于31.64%。2.3 不同目丝氨酸蛋白酶的系统发育树应用mega4.0软件neighbor joining（nj）法对包括asjsp在内的10种不同种类昆虫的丝氨酸蛋白酶进行系统发育进化树的构建（图3）

17、。结果显示，膜翅目、鞘翅目、半翅目昆虫丝氨酸蛋白酶较为分化，位于不同的分支上，可能与该目昆虫食性的不同及繁多的种有一定关系。中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶asjsp先与creontiades dilutus聚在一起，又跟绿盲蝽apolygus lucorum聚在一起，说明中黑盲蝽与creontiades dilutus（登录号：aal15154.1）进化关系最近，与绿盲蝽apolygus lucorum（登录号：jq609682.1）进化关系次之，与其他7种昆虫的进化关系较远。 2.4 中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基本理化性质预测分析通过expasy生物信息学资源网站的protparam工具推测中黑盲蝽丝氨酸蛋

18、白酶的基本理化性质，发现此蛋白质共包含295个氨基酸，预测分子式为c1 374h2 222n390o407s15，理论分子量为31.20 kda，等电点pi为9.38，不稳定系数为31.94，摩尔消光系数为33 055，总平均亲水性系数为0.114，故推测此蛋白质为稳定的疏水性蛋白质。使用tmpred软件预测跨膜结构，发现其有3个跨膜区，分别位于第120，5976和198215位，故推测该蛋白质为跨膜蛋白质。使用signalp工具对信号肽进行预测，发现中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因asjsp所编码的蛋白质具有信号肽结构，该信号肽位于120位氨基酸残基处。3 讨论通過rt-pcr和race技术获得了丝

19、氨酸蛋白酶基因的全长cdna序列asjsp。通过对比氨基酸序列的同源性，asjsp与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的一致性为55.70%，与creontiades dilutus（登录号：aal15154.1）的一致性最高，推测获得的克隆蛋白序列是丝氨酸蛋白酶家族中的一员。经过生物信息学分析，推测中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因asjsp所编码的蛋白质是一个疏水蛋白质，信号肽的切割位点可能是前20位氨基酸。研究表明，丝氨酸蛋白酶是昆虫消化系统中较为重要的蛋白酶。如华北大黑鳃金龟（holotrichia oblita）的丝氨酸蛋白酶hosp1、棉铃虫（helicoverpa armigera

20、）的丝氨酸蛋白酶ha-tlp及桔小实蝇（bactroceran）的丝氨酸蛋白酶bdorser，这些酶在消化系统中均发挥重要作用20-22。绿盲蝽（apolygus lucorum）取食不同的寄主植物后，其丝氨酸蛋白酶基因alsp3和alsp4在不同性别成虫的体内表达量均有明显差异23，24。为深入地探究中黑盲蝽的消化系统中丝氨酸蛋白酶的作用，本研究获得中黑盲蝽的丝氨酸蛋白酶基因，同时为以后研究中黑盲蝽体内的消化代谢提供理论基础。参考文献：1 ryan c a. protease inhibitors in plants：genes for improving defenses against

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