木质素降解研究（终搞）

1、歩談匹工大琴anhui university of science & technology本科毕业论文木质素降解的研究ligini degradation of research学院（部）：化学工程学院 专业班级：学生姓名：指导教师：2012年3月26日木质素降解的研究摘要评述了木质生物降解的最新研究进展，主要包 括木质素的生物降解机制、降解木质素的微生物种 类及其产生的和关酶类、微生物的代谢调控和分子 生物学。此外，对木质素降解生物的实际应用和应 用前景也进行了评论。关键词：木质素；生物降解；秸杆；白腐真菌；环境保护ligini degradation of researchabs

2、tractthe quality of the wood that the solution of the born down new grind investigate into the exhibition, the lord will including wood grain life quality that machine system, drop down solution of grain of wood solution microscopic things kind of class and its production was born of enzyme in close

3、, microscopic content of the generation x the control and points the son born to learn things. the outside, to wood quality grain drop solution which shall be born of border with and should be before using the scene also into the line evaluation theory.keywords： wood qualitative element; born conten

4、t drop solution; straw pole; white-rot fungus really; the environment the care摘耍2绪论1 -1. 简介-2l1基木概念21.2单体与结构31.3发展前景32. 木质素的降解简略421概况-4-2.2木质索的结构特点-4 -3.木质索降解微牛物的种类-5 -3.1种重要木质索降解酶5i. 木质素过氧化物酶(lip)5ii. 乍孟过氧化物酶(mnp)-7 -iii. 漆酶93.2二种木质索降解酶协同作川-10 -4应用全景-10 -4.1木质索降解酶的全景10 -4.2木质索降解酶的特性124.3木质素的降解微生物的酶

5、活性调控机理-13 -4.4木质素的4：物降解的应用16结论-17-参考文献18谢辞2绪论木质素资源十分丰富，是植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的有 机化合物，估计全球的木质素年产量可达1500亿t。然而，木质素资源并 没有得到有效的利用，大量的木质素作为造纸工业的副产物而排放，不仅 是资源的一大浪费，而且严重污染环境。采用物理和化学处理法，可减少 约50%的木质素排放，但治理成木高，易造成二次污染。利用生物技术降 解木质素，可以减少环境污染，变废为宝，实现资源再利用。因此，认识 木质索的结构特点和了解其生物降解的研究进展，对丁木质索资源的合理 化利用将具有一定的指导意义。1.简介1.1基本

6、概念木质素（lignin）是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-疑基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分z-,具有使细胞相连的 作用。在植物组织屮具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。其组成与性质比较复杂，并具 有极强的活性。不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。如果简单定义木质素的 话，可以认为木质素是对疑基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。它含有一定量的甲氧基，并有 某些特性反应。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作 用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。在 木本植物中，木质素占25%,是世界上第二位最丰富

7、的有机物（纤维素是第一位）。12单体与结构cftjc、ho c c 妙创*as殆构ho c c c时児荤矗給构木质素单体的分子结构木质素是出四种醉单体（对香豆醉、松柏醇、5-瓮基松柏醉、芥子醇）形成的一种 复朵酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许 多负电集团的多环高分子有机物，对土壤屮的高价金属离子有较强的亲和力。因单体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁 香基木质索（syringyl lignin, s-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈 创木基木质素（guajacyl lignin, g-木质素）和出对

8、-释基苯基内烷结构单体聚合而成 的对-轻基苯基木质素（hydroxy-phenyl lignin, 11-木质素）；裸了植物主要为愈创木 基木质素（g）,双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质索（g-s），单子叶植物则 为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（g-s-h） o从植物学观点出发，木质素就是 包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定 显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学 观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维索。

9、木质索填充于纤维 素构架屮增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵 袭。木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有。一般存在于豆类、麦联、 可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分 胆汁酸，并将其排除体外。1. 3发展前景随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入，天然高分子所具有的可再 生、可降解等性质口益受到重视。废弄物的资源化与可再生资源的利用，是当代经济与 社会发展的重大课题，也是对当代科学技术提出的新要求。在自然界中，木质素的储量 仅次于纤维素，而且每年都以500亿吨的速度再生。制浆造纸工业每年要从植物中分离

10、 出人约1.4亿吨纤维素，同时得到5000万吨左右的木质素副产品，但迄今为止，超过 95 %的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉，很少得到有效利用。化石能源的口益枯竭、木质素的丰富储量、木质素科学的飞速发展决定木质素的经 济效益的可持续发展性。木质素成本较低，木质素及具衍生物具有多种功能性，可作为 分散剂、吸附剂/解吸剂、石油回收助剂、沥青乳化剂，木质素对人类可持续发展最为 重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来源，其应用前景十分广阔。研究木质素性能和结构的关系，利用木质素制造可降解、可再生的聚合物。木质素 的物化性能和加工性能、工艺成为日前木质素研究的障碍。2.木质素的降解简略2.

11、 1概况绿色植物占地球陆地生物量的95%,其化学物质组成主要是木质素、纤维素 和半纤维索，它们占植物干重的比率分别为15%2%利12偸。农作物秸杆是这类生 物质资源的重要组成部分，全世界年产量为20多亿吨，而我国为5亿多吨。但 是，要充分、有效地利用这类资源却相当困难，这是由于秸秆产蚩随季节变化， 且量大、低值、体积人、不便运输，人多数动物都不能消化其木质纤维素，自然 降解过程乂极蟻慢，导致人部分秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造 成极大的环境污染和浪费。存在于秸秆屮的非水溶性木质纤维素很难被酸和 酶水解，主要是因纤维索的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维索缔合 的木质素鞘所致。木质素

12、与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在 其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分了接触，而木质素的非水溶性、 化学结构的复杂性，导致了福t的难降解性。所以，要彻底降解纤维素，必须 首先解决木质素的降解问题。22木质素的结构特点木质素是由苯丙烷单元、9/5 up通过瞇键和碳碳键联接的复杂的无定形高聚物，难以被酸水解，是天然高聚物中最难搞楚的个领域y其原因有两个方面，一是木质素的结构单元之间除腿键联扌妾外还有cc键；另一方面是不可能把整个木质素分子以其宀兀整状态分离出来c典型木质素是曲松柏醇(conifery alcohol)，芥 了 醇(sinapyl alcohol)和对一香豆醇(p

13、-coumaryl alcohol)这3种 不 同 的醇 作为先 体结构 物 质组成基木的结构单元，这些木质素结构单元常常以它们的 糖昔形式贮存在细胞屮，一旦需要合成木质素，它们便从这些 糖昔中释放出来 这些木质素结构单元z间主耍是通过瞇 键和碳碳键的方式联接醸键包扌舌酚瞇键、烷醸键和二芳醯 键。在酚瞇键中愈创木基-甘油-卩-芳基醯键（b-0-4）数量最多，占酚瞇键 的1/2左右，其次是愈创木基-甘油-a-芳基醴键（b-0-4） o而木质素的c-c键的连接 类型主要有3-5, b-b, bt, -2和5-5fc图i木质素（：（：键的连接类型3.木质素降解微生物的种类3. 1三种重要木质素降解酶

14、木质素是造纸工业排放黑液cod和色度形成的主要原因，其结构是由甲氧基取代的对-梵基肉桂酸聚合而成的界质多晶三维多聚休，分子间多为稳定的瞇键、c-c键, 是1=1前公认的微生物难降解芳香化合物之一。自1934年boruff和buswell首次发现能 降解木质素的微生物种群，人们对木质素的生物降解进行了大量研究，1983年和1984 年发现了木质素过氧化物猶（lip）和镒过氧化物酶（mnp）,由日木吉田首次在生漆中 发现的漆酶（laccase）,也始终引起着人们的关注。这三种酶被公认为是木质素重要 的降解酶。i 木质素过氧化物酶（lip）1.1分布及种类lip是第一个从黄抱原毛平革菌（phaner

15、ochaetechrysosporium）发现的木质素降解酶, 在木质素降解中起关键性作用°lip的产生菌在自然界分布相当广泛，许多腐朽木材的 白腐菌、褐腐菌都可以产生lip,主要产生菌见表1表1 lip的主要产生菌属名菌种名trametest. gibbosa? t. versicolxwphlehiap. hrispom, p. r(wliata < p. o(hmc(vf ulva p.p. adustacoriolusc. consom < c. hrsutusothersbl(rkan(lera aduata. (jirxsonilia sit <p hi

16、! a, (hysospcrium pridnosiffn. coriolopsis occidentalis. phdlinus pini、pohporus ostnp于ormis, ph(men)eh(ipte chry soporium t strejjt mnca viridosporu, pleurotus ostivatus t junpfi uhunia warabalima. fames lign osusi. ii结构及特点lip代表一系列含fe3+、吓嚇环（ix）和血红素附基的同t：酶，由不同微生物产生的酶的种类和理化性质各不相同°lip是一种带有糖基的胞外血红蛋

17、白，晶体结构已 有报道，确定血红素（heme）埋在蛋白质内，可连接至少一个va。木质素大分子不能接 近该酶的活性屮心，其结合位点是一段有序的糖残基，位于接近活性屮心通道表面的 裂缝屮。光谱学研究表明lip有五种氧化状态，自然状态lip含有髙自旋fc3+,被h202 氧化两个电子后形成lip 1（氧带铁吓咻环自由基含+ fe4+ ） , lip i经单电子还原 形成lip 11（氧带铁吓啦环含fe4+），再经一次单电子还原，冋到口然状态,his*?在活 性中心通道表面的裂缝的开口处,trpl70在酶蛋白表面，其电了传递可能有两个不同的 途径：底物- his82- ala83- asn84- hi

18、s47- heme 或底物-trp170- leu171- heme。lip的特点是能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物，在通过电子传递体攻 击木质素时，它能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化成自由基，继而 以链式反应产生许多不同的自由基，导致木质素分子中主要键断裂。此过程需要h202 的驱动，反应如下：lip+ h2o2->lipi+h2olip 1+ sh2tsh + upiilip 11+ sh2 t sh + lip2sh+ 2木质素t2木质素自由基+ 2sh2其中，sh2为专一电子传递体。h2o2可出白腐菌胞内h2o2产生酶系产生，且其胞内 还存在过氧化物水解酶，保

19、证其不会受到毒害。i. iii作用机制木质素分子间主要键型是p - 0- 4,b-0-4模式复合物屮有a, b两个苯环，均可被lip氧化。lip催化0- 4模型物的主要反应是c 卩断裂形成va和2-甲氧基苯酚。另一个重要的分支反应是c。-氧化产物 的形成，结果表明：co-氧化产物是酚型c°-氧合芳香化合物时，可由漆 酶催化，酚氧化酶介导的氧化反应降解；当氧化产物是非酚型 氧合芳香化合物时，曲于其非各种氧化酶的底物，氧化降解非常困难。va 是lip的诱导剂，还可以保护lip不受h2o2的损害。对va的氧化目前认 为主要是出lip催化，过氧化氢离子和h20同时参与芳香环的开裂。开环 产物

20、可被进一步代谢co?。整个反应中生成的甲氧基酚衍生物，由lip和漆 酶共同氧化，形成醞，在纤维二糖/醍还原酶系、芳香环开裂酶系的协同 作用下，生成酚，最后形成环开裂产物，进入kerb循环，或者纤维二糖 酸内脂的形式进入磷酸戊糖途径，最终代谢为co?。而非酚型的芳香醛酸， 由于其氧化还原电位太高，需先被芳香醛酸还原晦还原成和应的醇，然后 才能被lip氧化成开环产物或醞。在木质素的模式复合物屮，已被深入研 究的述有p - 1型，lip氧化其它键型如b-5、p-0-4模式复合物，产 物尚未被证实。i.iv基因结构及表达在分子生物学领域，研究较多的是p . chrysosporium> trei

21、metes versi col or、 bjerkandera adusta等。在p. chrysosporium中已经克隆出至少7个相近的lip基因 家族，定名为lipa- lipj,同源性很高。核型分析表明，异源真核菌株约含10个染色 体，而lip基因至少被分布在两个染色体上°lip序列排列紧密且高度保守，氨基酸相 似性53% 98%,每个lip基因编码一个由343345个氨基酸组成的成熟蛋白质，分子 量约36360 36607dao n端有一个21个氨基酸的信号肽，且有6或7个氨基酸的前体 肽。已测序的lip基因均含有8或9个内含子，大小4978bp, 5'端非编码区包

22、含一个tata框(-66 -81 bp)和一个caat框(-107-228bp)的调节序列。在基因表达 方面，其转录明显受到c, n水平的彫响,lip的同工酶种类和数日随培养条件变化而改变，至少有五种:hl、h2、h6、h8、h10。其分子量大小、等电点、光谱特性、稳定性均 有差别，n端氨基酸序列也不相同。非限制性n源条件下，h8是主要的同工酶 具cdna 序列被命名为ml- 1,h2的表达也稍占优势，但h6的表达较限制性n源条件下大大下 降。在异源表达上，已得到许多重组lip,但重组lip的功能有所改变，如催化能力改 变，不再受mr?+抑制等。ii猛过氧化物酶(mnp)ii. i分布及种类m

23、np与lip 样，都是代表一系列带有糖基的胞外过氧化物酶，因二者都含有血 红素，又称血红素过氧化物酶。mnp的主要产生菌见表2,主要是一些白腐真菌，多属 担子菌亚门，无隔担子菌亚纲，无褶菌冃的多孔菌科。ll.ll 结构及特点mnp的品体结构中包括17%的中性糖类和大量酸性氨基酸，血红素上仅有一个mn2+的 结合位点，mnp能将其氧化，消耗一分子的h202,产生两分子的mn3+。mn3+从mnp上 脱离后，如果没有合适的螯合物与其结合，保证其稳定性，其可以在溶液屮发生反应， 生成mn02o在木质素降解过程屮，mno2可保护lip免受h202的损伤。而在lip- mnp组 合酶体系屮，高浓度的mn

24、2+或mn3+ ,加上合适的螯合物，会导致lip的抑制,mnp的 诱导。可见，mn对lip和mnp都具有重要的作用，且作用大小与猛离子的浓度及添加 时间有关。mnp的特点是只能氧化酚型木质素。氧化苯酚的过程中，mnp和h202的启 动下，氧化血2+为mn3+,然后,mn3+氧化苯酚生成苯氧残基。这与lip氧化苯酚的方 式有明显不同。表2 mnp的主要产生菌属名菌种名pleurotusphlebiaparuisgm)(lemvitrainedothersp. sapidus, p. erynigij p. pulmonarius p. s(gor£(gup ireiipora p. r

25、arliatap (igrinus. p. condialus(； luculuni, (； vales uk unit. giljxtsa, t. micdor、t. villosa t cuigulalaceriporiopsis subirnuspora, q>ri(4oxs is pohzofm, lenti rmla d(l(ile(ps iscorfragosa.dichomitus stfualmspy(r(porus driri(j)(iri rms. (；rfda fr()ful()s(i, rigitloporuu ligruviits plianf9r(xhade

26、clirys(is)oriurn, sttraim hirsutimi. (y(ithus stereoreus perenniporia inalullajjanisii. ill作用机制mnp降解木质素的作用机制尚不清晰，h前认为是一个循环催化过程见图1, ah代表酚型底物。随着研究的逐渐深入，它在木质索降解过程中的作用越来越受到重视。ii. iv基因结构及表达从p . chrysosporium的胞外液中分离出至少六种mnp的同工酶，均由多基因编码。通过全部rna的反转录pcr,能得到mnp的三个不同基因的mrna:mnpl、mnp2、mnp3。 静置培养条件下，mnp2是主要的mnp表

27、达基因，而搅拌培养时，mnpl是主要的表达基 因,mnp3的表达较稳定。mnp基因有6或7个内含子,n端有21或24个氨基酸的信号 肽，但无前体肽。活性位点附近的序列非常保守，mnp的5 非编码区包括1个tataa单 元(-81bp)及3个反向的ccaat单元。启动区包括大量热休克元件和序列，这些元件 与哺乳动物金属硫蛋门基因中的金属调节元件相同4 5 o在基因表达方面，mnp的产生明显依赖mn2+浓度、培养基、热休克、c和n源变 化，且调节是在转录水平上。菌株pchrysosporium ogc1o1 mnpl编码一个357个氨 基酸的成熟蛋口，内含子6个，大小57 72bpoiii漆酶ii

28、li分布及种类1883年漆酶被首次发现，一百多年来，人们通过大量研究发现漆酶广泛存在于 多种植物和菌类的分泌物中。在真菌中，漆酶人多分布在担子菌(basidimycetes )、 多孔菌(polyporus )、柄孑包壳菌(podospora )等中。此外，一些动物肾脏和血清中 也发现了漆酶，近来，人们发现一些细菌也能产生漆酶6,如生脂固氮螺菌 (azospirillum lipof erum)。漆酶的主要高产白腐真菌王佳玲等曾作过统计。iii. ii结构与特点漆酶的分子量在64 390kd之间，除podosp oraanserina产生的一种漆酶是四聚 体外，其它漆酶一般是单一多肽，由约50

29、0个氨基酸组成。不同种类的漆酶含铜数并不 相同。一般含有四个铜离子，根据光谱和磁性特征可分为三类：i型c+ 个，单电子 受体，顺磁性，蓝色，入614nm处有特征吸收蜂；ii型cu2+ -个，单电子受体，顺磁性,菲蓝色，无特征，吸收光谱；iii型cu21+两个，双电子受体，反磁性，是偶合的离子 对(cu2+ - cu2+ ) , x 330nm处有宽的吸收带。漆酶的三维结构尚不清晰，但证实铜 离子位于酶的活性部位，在催化氧化过程中起决定性作用。漆酶是单电子氧化还原酶， 据统计它催化氧化的底物达250多个，最重要的是酚及其衍生物，约占其底物总数的 一半。此外漆酶还能催化芳胺、竣酸及其衍生物，當体激

30、素和其它非酚类底物，如抗坏 血酸等。iii. iii 作用机制漆酶是一类以6为电子受体的蛋白酶，对其作用机理，冃前研究较透彻的是其催 化多酚化物如氢酿，此过程须经过四次单电子传递。首先，底物氢醜向漆酶转移一个屯 子，生成半醍-氧自由基中间体。而后，两分子半醍生成一分子氢醍和一分子苯酿，氧 自由基中间体还能转变成碳自由基卩间体，它们可以相互结合或相互偶连，故在菌体 内，漆酶与其它氧化木质素酶系协同降解木质素。而在体外实验中，木质素单体在 laccase/ 02条件下会发生聚合反应。02存在条件下,还原态漆酶被氧化，02被还原成 水，此过程是通过四个铜离了协同传递电了和价态变化來实现的：cu2+

31、cu2+ cu2°+t2e 底物 tcu+ cu+ cu2°+t 分子内灯转移cu?+ cu2+ cu22+2ecu+ cu+ cu2+->2h+o2h2o 快tcu2+ cu2+ ( cu2o) 3+t2h+h20 慢tcu2+ cu2+cu24+iii. iv 基因结构及表达漆酶是由一个结构相近的基因家族编码，许多真菌的漆猶基因已被克隆和测序， hagaricus bisporus、neurospora crassa。从coprinus cinerens 中克隆dl13 个漆 酶基因lccl. lcc2和lcc3。其中lccl含7个内含子，大小为54 70bp，成

32、熟蛋白约521个氨基酸，有三个潜在的n-连接糖基化位点，c端有23个氨基酸的延伸序列，富含 arg和lys,其酶蛋白成熟至少需剔除信号肽、前体肽和c端延伸区。lcc2和lcc3均 有13个内含子，表达出的成熟蛋白氨基酸同源性80% olcc3和lccl的氨基酸同源性58%, lcc2和lccl的氨基酸同源性59%,而lcc3与asperg订lus nidulan漆酶的氨基酸同源 性只有18%。因此，界源真菌漆酶之间的氨基酸同源性较低，但在铜结合区具有较高保 守性。在异源表达上，曲霉是一个很好选择，a. oryazetataamylase和pichia past i系 统已成功表达若干不同来源的

33、漆酶丄ccl在米曲霉屮表达成功,90%以上的转化体表 现出漆酶活性，廿前，已有许多漆酶基因在酵母菌等真核生物中表达。3.2三种木质素降解酶协同作用对上述三种酶的研究主要集屮在液体培养方式上，结果显示采用静置培养，深层 培养利于酶的产生。已证明，木质素降解酶活性受c源、n源、微量元素、诱导物、培 养温度和ph值等因素影响。而p. cinnabarinus的漆酶产量却不受一些小分子芳香化合 物的诱导。确定单一一种酶在木质素降解中的功能非常困难，因为侮一种白腐菌所产生 的都不是一种木质索降解酶，如laccase和mnp单独存在都不能很好的降解木质索， 而两种酶同时存在时，木质素却能得到很好降解，表明

34、两种酶具有协同作用。有趣的是 当体系中一些条件变化时，体系中的两种或几种木质素降解酶会发生相互抑制现彖， 如液体培养条件下，mr?浓度增加会导致lip活力大大降低，而mnp和laccase的活力 却相应增加，这启示我们这种协同作用可能存在正负两种机制。不同白腐菌木质素降解 酶系的组成人不相同，口j分为四类：lip - mnp,如p . chrysosporium;lip mnp laccase, 女dtrametes gibbosa; mnp laccase, 如lent inulaz间的比例将直接影响木质素降解效果。各种酶系具体如何分工协作降解木质素，尚不 清楚，将是今后研究的一个热点。4应

35、用全景4.1木质素降解酶的全景在自然界中，能降解木质素并产生相应酶类的生物只占少 数。木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作 用的结果，其屮真菌起着主要作用。降解木质素的真菌根据腐 朽类型分为：门腐菌使木材呈白色腐朽的真菌；褐腐菌使木材呈褐色腐朽的真菌和软腐菌。前两者属担子菌 纲，软腐菌属半知菌类。白腐菌降解木质素的能力尤于其降解 纤维素的能力，这类菌首先使木材中的木质素发生降解而不 产生色素。而后两者降解木质素的能力弱于其降解纤维素的 能力，它们首先开始纤维素的降解并分泌黄褐色的色索使木 材黄褐变，而后才部分缓慢地降解木质索。白腐菌能够分泌胞 外氧化酶降解木质素，因此被认为是最主

36、要的木质素降解微 生物。忖前，研究最多的白腐菌有：黄孑包厚毛平革菌(phanerochete chrysosporium) > 彩绒 草盖菌(coridus versicolor)、变 色栓菌(thametes versicolor)、射脉菌(phlebia radiata)、凤尾菇(plcurotus pulmononanus)、朱红密孔菌(pycnoporus cinnabarinus)等这些菌多属于担子菌亚门，无隔担子菌亚纲、无褶菌a的多孔菌科.王佳铃等曾评述过19811995年间研究报道过的主要高产漆酶白腐真菌(表1)。表1主要的高产漆酶微生物属名菌种名polyponis(jor

37、ioluspleiirotus"minuspyvmponispolyntutus(riinodemiap. tvrsicolor , p. hirautus p. anceps，p. san取ineus(： irrsicolor)(c. hirsuius k c. consorp 。氏厂血必 p. 眄ocaju > p. eryn诲i p. pulmonariiisl. edodes, l. tirinusp cinnabariniis , p. sanguineus , p. coccineusp. versicolor > p. sanguineusg ludolum

38、 (； mlesiocimothenagaricus bisponis ifotrytis cinem» panus tiinus» irpex lacuis» daemea flat uiu fames annos rhs tonia pnwtieola ngroapora crassti lnzites be tulina , sporotrifhum pulendentinn pholiota nuiiabilis，schimis molle，stenim pujpureum t (joprimis congregaiiis > cerrvna uni

39、color > ceriporiopsis whttrmis- pom bjejkaradera adusta poliporus pinsitus difhomitus sfutilensa, pyricu- laria oryme fyalhiis bulleri褐腐菌的软腐菌中的有些种类也可以分泌一些降解木质素的酶类，但它们分解木质素的能力不是很强，因此，研究报道 较少.降解木质素的原核生物以放线菌为主，如链霉菌属(streptomyccs) > 节杆菌(arthrobaeter) > 小单抱菌展(micromonoyticum)和诺卡氏菌(nocardia)等。细菌中

40、有厌氧梭菌(clostridum xylanoyticum)、假单抱菌(pseudomonas)、不动杆菌(acinetobacter)和 芽砲杆菌(bacillus)等原核生物对于在土壤中木质素的转化和 降解具有重要作用，但土壤中木质索的降解据报导是土壤微 生物区系多种类型微生物协同进行的结果，而且进程缓慢，单一微生物纯培养的商业用途前景不很清晰，月这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶，这也决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对从属的地位.此外，很多植物病原微生物女hrhizoctonia solani r. praticola等也具有分解木质素的能力，但这类微生物在处理秸秆上的应用 前景不

41、大.在木质素降解微生物屮，研究得最多最彻底和最具应用 前景的是黄抱原毛平革菌。这种微生物的特点是培养温度髙 (37°c左右)，无性繁殖迅速，菌丝生长快且分泌木质素降解 酶能力强，它已经成为研究白腐真菌的一种模式微生物'它 的培养条件、代谢调控、分子生物学和遗传学及其在生产实 践上的应用等均已被研究的相当仔细。4. 2木质素降解酶的特性目前，关于木质素降解酶的研究工作主要集中在口腐菌所 产生的酶系。研究得较多，并认为最为重耍的木质素降解幽有 3种，即木质素过氧化物酶(lignin petoxidases/lip)、猛依赖过氧 化 物 酶(manganese pcrxidascs

42、/mnp)和 漆 酶(laccase) . lip, mnp和leicceisc只 是 分别代表一系列的同功晦。但各种微生物所产生的晦的种类 和一些理化特性是有所不同的。其中lip是第一个从黄抱原 毛平革菌发现的木质素降解酶，以后又分别从射脉菌，彩绒革 盖菌，变色栓菌中发现.laccase没有在黄砲原毛平革菌中发 现,而在phlebia, trametes, coriolus 等菌中发现。木质素的降解酶系是非常复杂的一个体系，很多问题至 今还不十分清楚.除了上述3种重要的酶外，其它的一些酶如 芳醇氧化酶(aa0)、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶及一 些还原酶、甲基化酶和蛋口酶等都参与或对木

43、质素的降解产 生一定的影响.lip和mnp都是带有糖基的胞外血红素蛋白乂称血红索过 氧化物酶(hcmc peroxidase),它们在反应中从苯酚或非酚类的苯 环上夺取一个电子而使后者形成一个阳离子基团，从而导致 木质素分子中主耍键的断裂.lip主耍是氧化苯酚使z成为苯 氧残基mnp主要是从mr?和的氧化中得到然后氧化苯酚 使之成为苯氧残基'而每种酶在木质素降解中的具体作用 还不甚清楚.漆酶(laccase)是含铜的多酚氧化酶，主要來源于生漆和真 菌。出于laccase的含糖量高，难得到x-衍射分析用的漆酶单品， 它的三维空间结构尚不清楚.但已经证实，漆酶中的铜离子 在催化氧化反应中起

44、决定作用根据磁学和光谱性质可将漆酶 中的4个铜离子分为3类：i型c十和ii型c+各1个，是单电子受体, 呈顺磁性，可以用核磁共振控测；iii型cu2+ 2个，是双电子受体， 反磁性，用核磁共振不能检测 ！ i型cf 呈蓝色，在x614nm特征吸 收峰；11型5決为非蓝色，没用特征吸收峰；iii型(x”的离w(cu2+-cu2+ ),在30处有宽的吸收峰.在木质素降解过程的机制和作用至今人们还不完全清楚。 作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳胺类等多种底 物的氧化作用。氧化酚或芳胺先失去一个电子生成口出基， 后者发生一系列非酶反应，氧化成酿，在有02存在时，还原态漆 酶被氧化o还原成水

45、9;底物自由基不稳定，可进一步发生键 的断裂或生成，导致裂解或聚合反应。因此，底物分子可进一步 合生成复朵的产物，也可催化芳香环支链ca 断裂。galian0等发现,当laccase和mnp分别单独存在时，都不能有效地 降解木质素，而2种酶同时存在时则木质素得到有效的降解， 这表明2种酶在催化木质素生物降解反应中具有协同作用. 此外还发现在反应中加入其它的酶，如葡萄糖氧化酶时，可显 著提高木质素的降解程度他们认为，这是由于laccase既有解 聚，乂有聚合木质素的能力，加入葡萄糖氧化酶可原laccase氧 化多酚产生的酿等阻止木质素的聚合作用，从而提高laccase的 降解能力.确定每一种酶在

46、木质素降解过程中的作用和功能是困难 的，因为至少目前木质素被微生物所产生的单一胞外酶彻 底、完全地催化解聚和降解的情况还没被发现每一种口腐 真菌所产生的都不只是一种能降解木质素的酶，在缺陷任一 种酶的体系中木质素仍能够较好的降解，而这些酶z间乂相互作用和影响，使其存在于一个协同作用体系屮虽然现在已 能用叱标识的合成木质素来研究木质素降解酶在木质素降 解中的作用机理，但由t木质素的结构复杂，木质素的彻底降 解需依赖微生物区系中多种微生物在较长时间内相互交替 的生长繁殖才能完成.4.3木质素的降解微生物的酶活性调控机理在白腐菌产酶的培养方式上，研究最多的是液体培养国内夕卜曾利用同有机、无机或复合碳

47、源和氮源来研究它们对微生物素降解能力和产酶能力的影响.还研究了碳源或氮源它们的影响结果表明，碳源和氮源是微生物降解木质酶的一个极为重要的影响因素.不同的单糖、双糖作碳源的矿质培养基培养豹斑革菌时， 用麦芽糖生物的生长量最高.标准培养条件下，以葡 照，甘露糖和麦芽糖使mnp分别增2倍和3. 8倍。酵母汁、牛醇胺等合氮有利于lip活性的提高，而甘氨酸、柠檬酸镀、乙 抑制lip的生成和活性.毛平革菌等白腐菌的木质素降解和木质素降解酶的产生是发生在氮源或其它营养被消耗的次级代谢过程中而细菌则与之相反，高浓度的有机或无机氮源都不能抑制木质素 降解，所产生的过氧化物酶也具有与生长相联和不受高水平 氮抑制的

48、特点我国学者李越中等曾对黄泡原平革菌合成木质素过氧化物酶的营养调控进行过较为详细的研究报道（表2、表 3) o表2不同碳源対黄他原毛苹革菌木索酶活力的影响碳源/（2gi：）酶活力/（ul）碳源/(2 g-l-1)酶活力/（ul"）di iiii繭糖265.2甘油126.3非还原性三糖戊醛糖d松三糖75.8d 核糖168.0上述糖等比混合4(1). 0d 木糖227.3毗喃型戊聚糖j阿拉伯糖122.1木聚糖12.6己醛糖咲喃型己聚耦d-葡萄糖324.2葡糖46.3己酮糖毗喃型己聚糖山梨糖101.0糊精429.4脱氧己糖可洛性淀粉42.1d岩藻糖0微晶纤维素172.6i岩藻糖176.8地

49、衣多糖193.7鼠李糖4.2海带多糖164.2还原二糖其他纤维二糖286.6葡甘聚糖29.5非还原二糖果胶147.4d松二糖0魏皮浸汁（1%）256.8蔗糖54.7表3不同氮源对黄抱原毛平革菌酶活力的影响氮源菌丝重/ mg酶活力/（u-l-1）无机氮14.2237.1(xil4)2so414.3283.6(xh4)2hpo417.198.0尿素19.20有机氮乙醇胺20.10丙烯酰彼18.5247.8石酸钱13.7350.6柠檬酸钱16.90甘氮战2l401尸谷氨战20.3257.5复杂氨酵母浸汁18.3389.2牛肉音20.7436.9注:氮源质虽浓度为12 mmol*l1.微量元素对于口腐

50、菌相关酶类的产生是有较人影响的。漆 酶是一种含铜的多酚氧酶，因此，cu对于漆酶的产生和酶活 性是相当重要的mn对lip和mnp都具有重要的作用，对漆酶的影响 也是显著的.btnnarme等认为,mr?*对lip有抑制作用，而对mnp则有 诱导作用，其作用的大小与mh的浓度及添加时间有关.c. subuermispora在mr?'浓度为11 x 10 'mol 1/时，木质素矿化速率最大， 而mnp和laccase的活性在4. 0x 106 mol i时最高.不添力umn2'nj*使 agaricus campe str is的laccase活性显著降低，但对其彩响是以c

51、u" 的存在为前提，如果没有存在,那么laccase的活性则与浓 度无关且酶活性始终很低有报道，高浓度的会提高phlebiabreispora 的laccase 活性，但对dichomitus 来说，laccas 活性都不受mrf 的影响.结构和木质素有关的低分子芳香化合物或木质素降解的 碎片化合物，可诱导laccase产生并提高具猶产量，这类化合物如 香草酸、藜芦醇、愈创木酚、吐温、甲苯胺等.在豹斑革耳菌上 还发现了专一的mnp诱导物3-甲基节醇.培养温度、通气状况，p h值乃至环境湿度等，也是影响木质 索降解酶产生的因素如黄他原毛平革菌的最适生长温度为 3 7 °c ,最适产酶温度为30°c豹斑革耳菌增加通气可使木质素矿 化率有所提高，而对于phlebia radiata来说，通氧则抑制其活 性.培养温度和p h值对laccas的影响因具体菌种而异，不同的 菌种有不同的适宜培养温度和p i【值.4.4木质素的生物降解的应用木质素的生物降解目前成功地用于生产实践的实际应用 尚不多见，但在有些方面的研究己经显现出诱人的前景.1）造纸工业 分解木质索的酶类在造纸工业上的应用 有两个方而，一是用改造旧的造纸工艺，用于生物制浆、生物漂 白和生物脱色-黄抱原毛平革菌和pbrevispora等在国外己经