乳酸菌的分离与初步鉴定

1、学院：漓江学院年级专业： 09 生物技术组员：吴汉川 7005杨隆荷 7006李 翠 7007王志远 7008乳酸菌的分离及初步鉴定一、实验目的1 了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法2 初步掌握军中筛选方法设计3 掌握平菌种的选育二、实验原理乳酸菌是指以糖为原料， 属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。 乳酸细菌 科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约 1-3 mm，圆形隆起，表面光 滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。乳酸杆菌呈杆状，成单

2、杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链 或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。平板涂布法 平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单 个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上， 经过培养， 由每个单个细胞生长繁殖 而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。生理盐水：称取 9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000毫升。四、实验器材与试剂含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、 95%乙醇、蕃红溶液、灭菌 CaCO3 粉末、 NaCl；BCG 牛乳培养基： (A) 溶液：脱脂乳粉 100g，水 500mL，加入 1.6%溴甲酚 绿 (，80灭菌 20min。(

3、B)溶液：酵母膏 10g，水 500mL，琼脂 20g, pH6.8, 121 湿热灭菌 20min。以无菌操作趁热将 (A) 、(B)溶液混合均匀后倒平板。1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿 9个, 500ml容量三角瓶 2个，25ml 无菌移液 管 1 只，20ml 无菌试管 7 只，1ml 无菌移液管 6只，培养基分装器一个，玻棒 2 根, 无菌涂布器 3 只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架， 载玻片，盖玻片， pH 试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签 等。五、实验步骤1. 菌悬液的配制取 1 洁净三角瓶，盛以 225ml 生理盐水； 7 只洁净试管，

4、各盛 9ml 的生理盐 水；加塞包扎于在 103kPa 121高压蒸汽灭菌 20Min，得到无菌生理盐水。将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品 25ml 加入盛有 225ml 无菌生 理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为 10-1 的 样品稀释液；将 7 只装 9ml 生理盐水的无菌试管，依次标记 10 -2、 10-3 、10-4 、10-5、10-6 、 10-7，再用无菌移液管吸 10-1的菌悬液 1ml 放入依次装有 9ml 无菌水的试管中， 稀释混匀便得到 10-2 稀释液，如此重复依次制得 10-3 10-7的稀释液。2. 倒平板把灭菌的 CaCO3加

5、入融化了的培养基中 ,于自来水中迅速冷却培养基至 46 左右 （手感觉到有点烫 ,但能长时间握住 ）,边冷却边摇晃使 CaCO3混匀 ,但不得产 生气泡。取无菌平板 9 个，编号标明 10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基 冷却到 50左右，按无菌操作法倒 9 只平板，每皿约 15ml；平置使培养基均匀 分布在皿底，待凝固。3. 分离方法用三支 1ml无菌移液管分别吸取 10-5、10-6 和 10-7的稀释菌悬液各 1ml，对号 接种于与之对应的 3 个无菌平板中，每个平皿放 0.1ml ；尽快用无菌玻璃涂棒将 菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上 20 Min ；然后倒置于 40恒温箱中培 养 48 小时。4. 菌落观察恒温培养 48 小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其 菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还 能产生 CaCO3 的溶解圈。5. 镜检 取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体 涂片；结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染