高效液相色谱HPLC柱效测定

1、实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离 和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动 相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统 所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间

2、有较好的 分离度。分离度(R)的计算公式为：R= 2t (R2)-t (R1) /1.7*(W1+ W)式中t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留 时间；W及W为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和 壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗 发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。表1色谱柱测试条件出

3、峰次序样品组成1邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3邻苯二甲酸二丁酯(DBP)如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表 1 配制几种物质的混合溶 液，在不同条件下进行 HPLC 分离检测。三. 仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪， 50ul 微量注射器。2、试剂甲醇(色谱专用)，高纯水四 . 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶( C8)柱温：室温流动相：初始为高纯水： 20，甲醇： 80检测器： DAD 检测器 ;检测波长： 220nm；进样体积：20山定量环，实际注射每次可控制在 40讪。2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻

4、苯二甲酸二甲酯(0.3880g/L),邻苯二甲 酸二乙酯(0.2770g/L),邻苯二甲酸二丁酯(0.3776g/L)。然后各取1mL储备液 用水和甲醇(20： 80)稀释至10mL，作为待测溶液。3、色谱测定(1) 按操作规程开启电脑， 开启脱气机、 泵、检测器等的电源， 启动 Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。(2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于 “LOA D位置，用微量注射器吸 取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至 “INJECT位置， 此时显示屏显示进样标志。(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分

5、离比。 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水(60:40)、甲醇-水(70:30) 直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗 15min。五. 实验结果（1）梯度洗脱条件如下t/min0237.5甲醇比例:80%80%95%80%只二2如（2）=2 （ X(3.241 2.585)=3 77 1.7(0.10020.1046 ).79232=3.48（注：此处及以下都为第一个1.7丫12（2）丫12（1） 1.7 （0.09700.1026 ）峰和第二个峰的分离度）R_2t R(2)- t R1.7Y12(2)+丫1,：2(1)（2）t/min0237甲醇比例80%82%10

6、0%80%mAU 0002500 -2000 -g1min2 1-500J) 246811(3)t/min02.53.56甲醇比 例80%,95%100%80%mAU 300025002000150010005001 0-500minR= 2t r(2)tR(i)= 2 汉(3.542 3.074)_2 901.7Y12(2) 丫"1.7 (0.0966 - 0.0930 )(4)t/min0126甲醇比例80%,95%100%80%1-500min6R=2t R(2)- t R(1)1.7 Y1 2(2)Yi2(1)2(3.256 -2.877)1.7(0

7、.07990.0879 )=2.59t/min00.51.56甲醇比 例90%95%100%90%mAU 30002500200015001000500minlU-1 0-500r= 2tR(2)一如二 2 (2.9662.743)=1.36<1.5,两峰没完全分离1.7丫12(2) 丫12(1) 1.7 (0.10890.0844 )六. 思考题(1)比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形 较好。但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？mAU*800-BU0 -400-DAD1 B. Sig=22D.16 Ref=360s 100(31 B31SM0004.D)3

8、i. J *1|11r|1111|b?11|111r|I1*i|iibnipa*iiB|11012345678mil图2缓冲液作流动相得出的色谱图图3乙腈-水（5: 95）作流动相得出的色谱图用缓冲溶液作流动相，可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定 相及键合相的破坏通常是不可修复的。（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会 使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。总之，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和

9、使检测器噪声增加。（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。分为两种情况，第一种情况为流 动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？1）对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗脱。要确保缓冲溶液与冲洗溶剂互 溶。如果不能互溶，首先要用水含量相对较高的溶剂冲洗系统和色谱柱，然后再用冲洗溶剂替换。2）对于不用缓冲溶液：以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。 例如， 90%100的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。如果效果不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐

10、步置换至乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、 庚烷等）。也可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用 50%DMS或 DMF水溶液 加以清洗。清洗几十倍柱体积后，再逐步置换返回原系统（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、 出峰时间的影 响及流速对分离度的影响。从五种梯度洗脱条件可以看出，随着水的比例减小，分离度也减小，但出 峰时间加快。所以应选择一个合适的流动相比例。流速较小，分离度更大，但出峰时间延长。七、分析与讨论1与气相色谱法比较，液相色谱法不受试样挥发度和热稳定性的限制，非 常适合于分离生物大分子， 离子性化合物， 不稳定的天然产物以及其它各种高分 子化合物等。 液相色谱中的流动相不仅起到使试样沿色谱柱移动的作用， 而且与 固定相一样， 与试样发生选择性的相互作