青霉菌的原生质体制备技术研究

1、青霉菌的原生质体制备技术研究薛康平 任富亮 邢建广 王越甲 摘要：实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基， 液体震荡 培养温度28C,培养42h,蜗牛酶的浓度为5mg/ml,酶解3.5h，酶解温度33C , 稳定剂采用 0.7mol/LNacl ，此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体。 关键词：青霉菌 原生质体 蜗牛酶1 原生质体简介细胞壁被酶水解剥离, 剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体 Weibull 等于 1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌 ( Bacil lus megaterium) 细胞获得原生质体。 其形状随不同菌类而异, 革兰氏阴性菌经酶水解后细

2、胞壁 尚有残余部分,细胞具刚性,保持球形,称为原生质球或球质体；革兰氏阳性 菌细胞壁去除彻底,失去刚性,原生质体类似于球体。不论原生质体或原生质 球都基本保持原细胞结构,活性和功能,只是因为它们去掉了细胞壁,对渗透 压特别敏感。原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术, 它是以微生物原生质体为育 种材料,采用物理或化学诱变剂处理,然后分离到再生培养基中再生,并从再 生菌落中筛选高产突变菌株。Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单 抱菌(Micromonospora rosaria )取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素， 酶制剂,有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。丝状真

3、菌原生质体的提取方法有三种：机械法，非酶分离法和酶法。采用 前二种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于一些特定菌株，因此并 未得到推广。 在实际工作中， 最有效和最常用的是酶法， 该法时间短， 效果好。 到目前为止，适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到 直接亲本， 采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养， 取年轻的菌体转入到高 渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下(温度，pH值等)酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10mi n

4、,洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中， 即可得到纯化的原生质体。 酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应， 作为底物的细胞壁， 其组成与结构 又与培养基成分，培养条件，菌齢和预处理等因素有关。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株 青霉菌，来自河北科技大学（生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株）2.1.2 培养基 马铃薯低渗培养基 马铃薯等渗培养基（即含 0.7mol/l NaCl 的上述培 养基）2.1.3 试剂蜗牛酶，石炭酸复红染色液，蔗糖，KH2PO4.7HO, MgSO酵母膏，NaCI。2.1.4 仪器与设备（1）IA-1003 电子天平 ,TGL-1

5、6C 台式离心机，光学显微镜，超净台，恒温 箱，电磁炉，4 C冰箱，高压灭菌锅。（2）移液枪及枪头， 1.5mI 离心管，小医用注射瓶， 100mI 量筒，锥形瓶， 培养皿，烧杯，镊子，酒精棉球，绳子，接种针，封口膜，报纸。2.2 方法2.2.1 配制马铃薯低渗培养基（1）称取土豆434.97g，切成小块，放入锅中煮。用纱布过滤除去土豆泥， 得到土豆汁 500mI。（2）称取 2g 蔗糖， 0.5g KH 2PO4.7H2O、0.5g MgSO4、1.5g 酵母膏放入烧杯 中，从原土豆汁中取出160ml 并放入烧杯，再加水至 500ml。（3）取100ml于锥形瓶中，加入2g琼脂，其余的分装入

6、3个锥形瓶。（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。（5）灭完菌后，固体培养基倒平板，液体培养基放入 4C冰箱保存。2.2.2 配制马铃薯等渗培养基（1）称取 0.4g 蔗糖，0.1g KH2PO.7H2O 0.1g MgSC4、0.3g 酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出 32ml 一并放入烧杯，再加 0.7mol/l的NacI至100ml。(2) 称取 2g 琼脂放入烧杯中。(3) 混匀后分装入 5 个锥形瓶。(4) 做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。2.2.3 配制不同浓度的蜗牛酶液 称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中，并加水至2ml,此即为浓度10mg/ml 的蜗牛酶液。(

7、2) 从上述酶液中分别取 80、240、400、560、720于小医用注射瓶中，并补 水至 800ul 。(3) 此即为浓度分别为1、3、5、7、9mg/ml的蜗牛酶，用记号笔做上标签。2.2.4 配制 0.7mol/l Nacl 溶液称取32.76gNacl固体溶于无菌水中，定容至 800ml,灭菌并4C保存。2.2.4 青霉菌菌株的活化将保存在冰箱中的青霉菌接种在新配制的马铃薯固体培养基中。28 C恒温箱中培养 2-3d 。2.2.5 原生质体制备(1) 接种：培养好后，从平板培养基中，取一环菌接种于马铃薯液体培养基中，33。C恒温摇床分别培养36h、42h、48h。(2) 离心：将培养好

8、的青霉菌在 12000r/min下离心5min.(3) 洗涤: 弃上清液，将沉淀用 0.7mol/L Nacl 洗涤两次。(4) 酶解：将洗涤完后每个培养时间的青霉菌分装于5个小离心管中，每管60mg新鲜菌丝体，向这些离心管中分别加入 0.6ml浓度为1mg/ml、3mg/ml、 5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml 的蜗牛酶。33°C振荡培养 3.5h.(5) 过滤：酶解液用 4 层擦镜纸过滤，滤去未酶解的菌丝。(6) 离心：滤过液4000r/min离心10min,收集原生质体。(7) 洗涤：所得沉淀用 0.7mol/L 的 Nacl 洗涤离心三次， 用等量的 0.7mol/L

9、 的 Nacl 悬浮原生质体。(8) 观察并计数：在显微镜下观察原生质体的形态并计数。3 结果与讨论3.1不同浓度蜗牛酶酶解条件不同浓度蜗牛酶酶解条件下得到的原生质体如下:图1 1mg/ml蜗牛酶图2 3mg/ml蜗牛酶图3 5mg/ml蜗牛酶图4 7mg/ml蜗牛酶图5 8mg/ml蜗牛酶液体培养36h以上实验的结论是5mg/ml的蜗牛酶的效果最好3.2菌龄对青霉菌原生质体形成的影响以5mg/ml蜗牛酶处理青霉菌，考察了培养时间对原生质体形成的影响结果如下:图6液体培养36h图7液体培养42h图8液体培养48h图9液体培养54h液体振荡培养42h的青霉菌原生质体的得率最高。这可能是因为菌体的

10、不同 生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。 青霉菌 原生质体制备一般取对数生长期的细胞， 此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细 胞的化学组成、形态及生理特征比较一致。对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构 对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌 丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大。4小结确定了丝状真菌一一青霉菌原生质体形成最佳的部分条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28°C,酶解3.5h，酶解温度33T ,不用预处理, 稳

11、定剂采用 0.7mol/lNacl 。本次实验分别从菌龄、蜗牛酶的浓度等方面研究了 提取丝状真菌青霉菌原生质体的最优条件。所得结论如下：1. 菌龄对青霉菌原生质体提取存在着比较大的影响。在相同的培养条件下，通 过比较液体摇床震荡培养 36h、42h、48h 的青霉菌，得出的结论是：培养 42h 的青霉菌释放原生质体的数量最大。2. 蜗牛酶浓度对青霉菌原生质体提取也存在着比较大的影响。在相同的培养 条件下，通过比较1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的蜗牛酶浓度对原 生质体形成的影响，得到的结论是：蜗牛酶的浓度为5mg/ml时，能制备最大量的 原生质体。参考文献1

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