喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定

1、安徽农业大学学报, 2010 , 37( 4): 748 752journa l ofanhui a griculturalu n iversity喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定蔡永欢 , 花日茂*, 柏钰, 秦玲, 操海群 , 吴祥为(安徽农业大学资源与环境学院, 安徽省农产品安全重点实验室, 合肥 230036)摘要: 采用组织分离法 , 以 pda培养基为分离培养基,从 喜树的枝 条、 叶片 、 果实 和根中分离 获得 28株内生真菌 。对峙试验结果显示, 28株内生真菌对6种植物病原菌均有不同程度的抑制作用; 其中 g 4菌株作用最 明显 ,对苹果腐烂病菌( vals

2、amalim iyabeety amada)、 茄褐纹病菌p ho mopsisvexans( sacc . et syd . ) h arter的抑制率分别为 89 68 %和 83 88% 。对 g 4菌株生物学特性测定 结果表 明, g 4菌 株生长 最适温 度为 28, 最适ph 范围为6 4 8;在麦芽浸粉培养基上g 4菌丝生长迅速 ; 果糖为最佳碳源。关键词 : 喜树 ; 内生真菌 ; 抑菌活性 ;生 物学特性中图分类号 : q939 9文献标识码 : a文章编号 : 1672 352x( 2010) 04 0748 05isolationof endophytic fungus

3、from camp totheca acum inata d ecneand its inhibitionactivitiesto plant pathogensca i yong huan , hua r imao , ba i yu, qin ling, cao h ai qun,wu x iangwei( schoo l ofr esources and environ men, t anhuia griculturalu niversity , keylaboratory ofagri foodsafetyofanhui province , h efei230036)abstract

4、: taken on potato dextrose agarasasm ediu m, 28 strains of endophytic fungi were isolated from theste m s ,leaves ,fruits and rootsofcamptotheca acuminata decnew ith tissue isolation method . the results of platconfront indicated that 28 strains of endophytic fungi had so me inh ibition on the six p

5、lantpathogens ;the strain g4 has significant effecton pathogens , and the inhibition rates tovalsa mali andphomopsis vexanswere more than89 68 %and 83 88 % , respecti vely . biological characteristicsof strain g 4 was studied , and the result sho wed thatthe strai n g 4 gre w well at 28w ith ph 6 4

6、8 ; m alt po wderwas the bestm edium for its grow th , and fructosewasthe suitable carbon sources .k ey w ords: camptothecaacuminata decne ; endophytic fung; i inhibition activities ; biological characteristics喜树(camptotheca acuminata decne) , 隶属于山茱萸目( cornales)蓝果 树科 (n yssaceae),为我国特有树种 , 主要分布于长江流域

7、及西南各省 1。该树可产生抗癌和抗逆转录病毒的生物碱如喜树碱和10羟基喜树碱等 2。目前已报道有关喜树的研究,包括喜树的生态学研究 3、 喜树体内喜树碱的相关研究 4 5以及喜树内生菌与喜树碱和抗肿瘤物质关系的研究 6 8 等。植物内生真菌( endophyte), 是指在健康植物寄主的各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌。研究表明, 植物体中存在内生真菌是普遍的 9。目前 , 有关植物内生真菌能够直接或间接抑制植物病原菌的报道有很多 10 12, 但查阅国内外文献,很少有关喜树内生菌抑制植物病原菌方面的研究。本试验以喜树的叶、 果实、枝条和

8、根为材料, 进行了内生真菌的分离、 筛选及其抑菌活性研究, 旨在收稿日期 : 2010 04 28基金项目 : 安徽省学术技术带头人项目和安徽省科技攻关计划项目(08010302166)共同资助。作者简介 : 蔡永欢 ,男, 硕士研究生。 e mai: l caile13 163 com*通讯作者 :花日茂 , 男,博士 , 教授 ,博 士生导师。 e mai:l ri maohua ahau edu cn获得具有研究和应用价值的内生真菌资源, 为喜树内生真菌的研究、 活性物质的开发及其有效利用奠定基础。现将研究内容报道如下。1 材料与方法1 1 材料1 1 1供试菌种分离材料来源菌种分离所用

9、材料为无病虫害、 生长旺盛的喜树枝条、果实、叶片和根部组织。于10月份采自安徽农业大学校园。1 1 2 供试拮抗病原菌选用植物病原真菌6种:茄褐纹病菌(phom opsis vexans ( sacc . et syd) h arter , qhw )、 番茄枯萎病菌(f usarium oxys porum . fsp . lycopersici, fqk w )、 苹果腐烂病菌( valsa malim iyabeetyamada ,pgfl )、 枣 炭疽病 菌(gloelsporium fru ctigenum blerk , ztj)、 梨黑星病菌(ventur ia pirina,

10、lhx )、 葡 萄 灰 霉 病 菌(b otrytiscinerea , pthm)。均由安徽农业大学植保学院病理实验室提供。1 1 3 供试培养基 13试验选用7种培养基。pda培养基 : 马铃薯200 g , 葡萄糖20 g , 琼脂20 g,水 1 000 ml。玉米粉琼脂培养基: 玉米粉30 g , 琼脂20 g ,水1 000 ml。燕麦片琼脂培养基: 燕麦片30 g , 琼脂20 g ,水1 000 ml。组织煎汁液培养基:喜树嫩枝、 叶片和果实200g , 琼脂 20 g , 水 1 000 ml。麦芽粉培养基 : 麦芽粉25 g , 琼脂 20 g , 水 1 000ml。萨

11、氏培养基 : 蛋白胨10 g , 琼脂20 g , 麦芽糖40g , 水 1 000 ml。查彼培养基 : 硝酸钠2 g , 氯化钾0 5 g, 硫酸铁0 01 g ,磷酸氢二钾1 g,硫酸镁0 5 g , 蔗糖30 g ,水1 000 g 。1 2 方法1 2 1 内生真菌的分离与纯化取新鲜喜树枝条、果实、叶片和根部组织, 每个部位选用标样20块。采用组织分离法 13进行分离 : 自来水表面清洗干净! 消毒纸巾吸干水分! 75 % 酒精漂洗4 5 m in! 无菌水冲洗3 4次 ! 消毒纸巾吸干水分!15%的次氯酸钠漂洗2 3 m in( 叶片适当缩短时间) ! 无菌水冲洗4 5次, 无菌条

12、件下将枝条和根韧皮部切去再切成5 mm ? 5mm 小块 , 种子切成5 mm ? 10 mm大小 , 叶片 5 mm ? 5 mm 大小 , 置于pda平板培养基上28避光恒温培养 ; 最后一次冲洗无菌水涂抹于新的pda平板上作为对照, 用于检验表面消毒是否彻底 , 如有培养物生成, 表明表面消毒不彻底, 分离结果无效。平板培养2 3 d 后, 待 培养组织边缘长出菌丝, 用接种针挑取边缘生长良好的菌丝,分别接种在新的 pda培养基上 , 待新接种的菌丝长成菌落后,再挑取其边缘的菌丝培养,如此反复纯化,得到纯化的菌株。观察记录菌落的生长情况及特征。将纯化好的真菌作为菌种放在4冰箱中斜面保存。

13、1 2 2内 生真菌 拮抗效 果测定采用 对峙培 养法 14, 无菌条件下 , 取活化好的内生真菌和供试病原菌 , 用打孔器制成直径为6 mm的菌饼 , 分别移至pda平板上 , 二者相距2 5 cm, 以只接病原菌的作为对照 (处理和对照均设3次重复 ), 置于28下恒温避光培养。观察记录病原菌菌落的生长状况及抑菌作用 , 测量菌丝扩展半径, 计算抑菌率, 筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌。抑制率 (% ) =(对照菌落 半径 - 处理 菌落对峙面半径 )/ (对照菌落半径)?1001 2 3g 4内生真菌的生物学特性测定 15( 1)不同培养基对菌落生长的影响。将内生真菌g 4菌碟

14、接种于不同培养基中心位置, 28下避光恒温培养。每隔24 h测定菌落扩展量。( 2)不同温度条件对菌落生长的影响。取内生真菌 g 4 菌碟接种在pda 中央 , 分别置于20、25 、28 、 30、 35和 37不同温度条件下避光培养。每隔24 h测定菌落扩展量。( 3)不同p h 值对菌落生长的影响。接g 4菌碟接种于p h 值为 2 4、3 4 、4 75 、6 4 、8 、9 2、10 2、11 5的 pda 培养基平板上, 28避光恒温培养, 每隔 24 h测量菌落扩展量。( 4)不同c源对菌落生长的影响。选用查彼培养基 , 将 c源分别以木糖、 果糖、 可溶性淀粉、 蔗糖、麦芽糖、

15、乳糖、葡萄糖计7种碳源和无糖替换, 接种g 4菌饼于平板中央置于28下避光恒温培养。每隔 24h观察测定菌落扩展量。菌落扩展量测量方法: 采用十字交叉法测量菌落直径 , 菌丝扩展直径=(x1+ x2- 2 x ) /2 , x1、 x2:十字交叉法所得直径, x: 菌碟直径。2结果与分析2 1内生真菌分离与纯化结果试验从喜树的不同组织共分离出28株内生真菌。其中 , 枝条中的内生真菌为10 株, 叶片中的内生真菌为12株 ,果实和根部各分离得到3株, 可见74937卷 4期蔡永欢等喜 树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定宿主植物不同部位所分离获得的菌株数有所差异,以叶片分离获得的内生

16、真菌数最多, 而果实和根部较少 (表 1)。表 1 喜树不同组织内生真菌的分离结果table 1isolation of endophyticfungi fro m ca mptotheca acu m inat a decne in the different parts分离部位isolated tissue样本数sa mplesno .数量 / 株number/s train占总菌株数的比例/%proportion of occupyingthe total number菌株code of strains枝条 ste m201035 7zt 1 zt 7 , zt#?叶片 l eaf201

17、242 9y 1 y 12果实 fruit20310 7gs1 gs 3根 root20310 7g 1, g 2, g 4表 228株内生真菌对6种植物病原真菌的抑菌效果table 2inhibiti on ratio of 28 strains against 6 speciesof plant pathogens菌株编号strainsno .植物病原菌抑菌率/%inhibition ratio of plant pathogenspgflqhwfqkwztjlhxpthmzt 157 82b-66 11w+38 46z-18 70b-41 30z+44 32z-zt 267 53b-58

18、 43w+41 03z-39 23z -58 43z-41 30d-zt 355 00b-58 70z-16 67z-45 43d-27 44z+15 90d-zt 465 43b-38 46z+30 00z-35 74w -37 53z+45 76d-zt 541 30b-31 60z-26 19b-58 43d-54 42z-46 11d-zt 668 88b-66 00z+28 88z-38 46z -43 04z-58 94z-zt 735 74b-48 57z-41 30z-48 57z -43 80z+48 84d-zt#56 19b+27 44w+43 04z-36 00z +6

19、0 78z+41 03z-zt%48 57b-52 09z-34 35b-40 00z -66 67z+46 15d-zt?26 19b-48 84w+41 30z-50 00z -54 90z+38 46d-y 145 34b-44 32z-44 32z-39 13z -66 67z-43 18d-y 237 53b-65 90z-58 94z-54 42z -74 42z-36 96d-y 359 23b+46 71z+43 00z-56 19z -50 00z-45 34d-y 465 72b+45 80z+56 78z-65 71z -66 67z-26 11d-y 543 38b-3

20、4 54z-46 11z-46 11z -54 12z-45 78d-y 635 67b-46 12z-16 67z-34 54z -43 38z-52 09d-y 740 00b-65 76z-41 03z-43 38z -41 30z-45 78z-y 843 80b-45 78d+65 72z-43 81z -27 44z+23 81d-y 932 15b-54 70w-66 67z-45 78z -58 70z-43 00d-y 1058 94b-65 42w-54 70z-34 12z -60 47z-35 71d-y 1156 90b-34 56z+78 45z-58 70z -5

21、6 90z-31 11z-y 1265 71b-74 42z-58 70z-40 00z -66 67z+46 67z-gs 165 11b-67 45z+32 88z-15 34z -56 89z-26 11z-gs 259 37b-39 13z+43 90z-44 19z -43 18z-16 00z-gs 343 81b+60 47z+36 96z-50 00z -78 43z+11 79z-g 154 12b+43 00z-31 11z-43 11z -56 78z-54 11z-g 284 13b-54 35w+48 14z-58 14z -61 36z-62 00z-g 489 6

22、8w+83 88w+69 60w-78 45w +60 78w -61 17w +注: - :无抑菌带 ; + :有抑菌带 ; z : 病原菌菌丝生长正常; b : 病原菌包围内生真菌; w: 病原菌菌 丝萎缩 ; d : 病原菌 被内生真菌包围。note : &- ?: n o inhib ition zone ; & +?: inh ibition zone ; & z ?: h yphaegrowt h nor mally ; &b?: pathogenenvironsendophytic f ung; i &w?: pathogenhyphae

23、shrink; &d?: pathogen is environedby endophytic .750安徽农业大学学报2010年2 2内生真菌拮抗作用效果内生真菌28个菌株对供试病原真菌抑菌作用测试结果表明(表 2): 对峙病原菌与内生真菌相对面的菌丝半径均小于对照菌丝半径, 均表现出一定的抑菌效果。其中g 4内生真菌较为明显, 对 6种病原菌抑菌率均达到60 %以上 , 高者达89 68 %; 显微镜观察病原菌菌丝均出现萎缩、畸形现象 , 有抑菌带产生 , 其他内生真菌无此作用现象。除 g 4内生 真菌 的其 他对峙 试验 中, 病原 菌fqkw、z t j 、 lhx、 qhw

24、菌丝生长状况表现正常, 病原菌菌丝与内生真菌菌丝对峙接触界为1条直线 ,而 pgfl病原菌出现包围 内生真 菌的现 象, pthm病原菌多被内生真菌包围;与番茄枯萎病菌对峙中,内生真菌zt %和 zt 5菌丝包围番茄枯萎病菌菌丝, 接触处有土黄色色素产生。由于抑制作用表现形式也不同, 有的能产生抑菌物质 , 形成抑菌带而抑制病原菌生长, 有的则与病菌接触产生竞争作用或者重寄生作用而达到抑制效果 16。从表2结果可以看出:同一内生真菌, 对不同病原菌的抑制效果有明显的差异;对于同一病原菌与不同内生真菌的对峙中, 病原菌的被抑制率大小也不同 ; 而内生真菌g 4对 6 种病原菌均有较高的抑制作用,

25、且抑制率均大于其他内生真菌, 可见g 4菌株具 有很 强的 抑 菌活 性, 有 进一 步 研究 的价值。2 3g 4菌株生理特性测定2 3 1不同培养基对菌落生长的影响试验结果(图 1)表明 : 在 28条件下 , g 4菌株在麦芽浸粉培养基和pda培养基上生长较好, 在麦芽浸粉培养基上 96 h菌丝扩展直径达6 48 c m, 在 pda培养基上达 6 25 c m,在组织煎汁液培养基上生长量最少。2 3 2不同温度对菌落生长的影响由图2可以看出 , 内生真菌g 4在 28条件下96 h生 长量最大, 与其他温度条件相比差异极显著, 且菌落生长迅速, 菌丝粗壮 , 致密 , 颜色棕黄 , 气

26、生菌丝多。35、37条件下 生长 迟缓 , 菌 丝纤 细, 颜色 浅淡 , 边 缘不齐。2 3 3不同碳源对菌落生长的影响碳源是真菌的碳素营养来源, 是合成碳水化合物和氨基酸的骨架, 还是维持菌丝生长的重要能量来源 17。通过图3可以看出 , 内生真菌g 4在 7种糖及无糖条件下都能生长 , 蔗糖作为碳源时菌丝生长比乳糖慢, 二者生长速度均低于无糖条件;果糖作为碳源时, 菌丝生长速度最快 ; 木糖、可溶性淀粉和葡萄糖差异不明显。以查彼培养基为基础培养基测定碳源对菌丝生75137卷 4期蔡永欢等喜 树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定长影响的实验结果表明内生真菌g 4在无糖的情况下也能

27、生长 , 对碳源有一定的选择性。2 3 4不同ph 对菌落生长的影响从图4中可以明显地看出, g 4菌株在p h 值 3 4 11 5的 7个梯度范围内均可生长, p h 值 6 4和 8 0时菌落生长最好 , 氢离子浓度过高或过低时菌落生长较差 , ph值为2 4时菌丝不长。说明内生真菌g 4能够在一定范围内强酸强碱条件下生长。3 小结与讨论从已发表的文献来看, 关于喜树的研究多体现在喜树的生态学和临床医学方面, 有关喜树及其内生菌在抑制植物病原菌方面的研究很少有报道。本试验以喜树的叶、 果实、枝条和根为材料, 进行了内生真菌的分离、 抑菌及生理特性研究。本试验采用传统的组织分离法, 此方法

28、的关键在于表面消毒的效果如何, 消毒不彻底影响分离结果的准确性 , 消毒时间过长则有可能杀死组织内部的微生物。为此根据实际情况在消毒时间上做了适当的调整 , 并且用最后一次冲洗无菌水涂抹于新的pda平板上作为对照, 来检验表面消毒是否彻底,以提高分离结果的可信度。本试验分离所得的内生真菌数量与文献 7 相比相对偏少, 这可能和样品喜树的树龄、 生长环境、采集季节和时间等有关;另本实验分离培养基内未加抗生素, 也可能是分离所得内生真菌数量少的一个因素。生防菌拮抗机制可分为抗生作用、竞争作用、重寄生作用 , 此外还包括诱导抗性、溶菌作 用 15等。在内生真菌对病原真菌的对峙试验中, 两种对峙真菌对

29、环境的需要相似,多会发生竞争作用; 抗生作用是指一种微生物对另一种微生物的毒害作用, 相对而言 , 具有抗生作用内生真菌的开发与应用前景十分广阔。从本试验对峙结果看,所有内生真菌对供试病原菌均有不同程度的抑制作用。菌株g 4使多种病原菌菌丝萎缩、 畸形而停止生长, 说明内生真菌g 4抗生作用可以抑制病原菌的正常生长。内生真菌长期生活在寄主体内部, 一旦从寄主植物中分离出来后, 自身的一些特性也会随之改变,菌种容易出现退化等现象 18。本试验测定了内生真菌 g 4菌株的生理特性, 初步确定了内生真菌的最适生长条件, 但在这一条件下内生真菌原有的生理代谢活动是否会发生改变, 菌株是否能够充分发挥抑

30、菌活性等问题尚待进一步研究。参考文献 : 1 中国科学院 中国 植 物编 辑委 员会 . 中 国植 物志 m .北京 :科学出版社 , 1983 , 52( 2): 144 147 . 2 sakato k, m isawam. effects of chemical and physicalconditions ongrowt h ofca mp tothecaacu m inata cell cultures j. agr biol chem, 1974 , 38( 3): 491 497. 3 张德辉 .喜树资源 生态学 的研究 d . 哈尔 滨: 东北林业大学 , 2001 . 4 孙雁霞 ,邬晓勇 , 王跃华 . 喜 树碱提取 方法研 究 j. 成都大学学报 :自然科学版 , 2008 , 27( 2): 8991. 5 杨磊 ,李 晓 娟, 赵春 建. 生物 碱 在 喜 树植 株 中 的 分布 j. 植物生理 学通