微生物量碳的测定方法3页

1、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(23 mm)，或放在低温下(24)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(24)最好不要超过10d。土壤田间持水量采用改进的Sh

2、aw（1958）方法测定。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。林启美老师文件内容二、方法氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。2、仪器及设备培养

3、箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。3、试剂1. 无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液j(H2SO4)=5%，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸 j(H2SO4)=9598% ，稀释19倍）2. 硫酸钾溶液c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。

4、(需加热溶解)3. 重铬酸钾c(1/6K2Cr2O7)=0.2000 mol·L-1: 称取经130 oC烘干23h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）9.8110g，溶于1000mL的去离子水中。4. 重铬酸钾标准溶液：c(1/6K2Cr2O7)=0.1000 mol·L-1: 称取经130 oC烘干23h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）4.9055g，溶于1000mL的去离子水中。5. 邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉指示剂C12H8N2·H2O，分析纯1.49g，溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去离子水中，密闭保存于棕色瓶中。6

5、. 硫酸亚铁溶液c(FeSO4)=0.05 mol·L-1：称取硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)约13.9005g，溶解于600800mL去离子水中，加浓硫酸（化学纯）20mL，搅拌均匀，定容至1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不稳定，需在用时每天标定其浓度。7. 硫酸亚铁溶液浓度的标定： 吸取重铬酸钾标准溶液5.00mL，放入100mL三角瓶中，加水约20mL,加浓硫酸5mL和邻啡罗啉指示剂2滴，用FeSO4溶液滴定，根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。硫酸亚铁溶液标定方法：吸取0.1000 mol L-1（1/6 K2Cr2O7）标准溶液(试剂

6、4)5.0ml，放入150ml三角瓶中，加浓硫酸5ml和邻啡罗啉指示剂2滴，用硫酸亚铁溶液滴定，滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度，即C2 =（C1 ´ V1）/ V2。式中：C1重铬酸钾标准溶液浓度（0.1000mol L-1）；C2硫酸亚铁标准溶液浓度（mol L-1）；V1吸取的重铬酸钾标准溶液体积（5ml）；V2滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积（ml）。4、操作步骤4.1薰蒸 称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100 mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装

7、有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门，在25oC的黑暗条件下放置24h。打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，用K2SO4溶液(见下一步骤，试剂2)浸提，同时

8、做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，4下放置1个月或在-15oC下保存。4.2浸提 薰蒸结束后，将土壤全部转移到250 mL的塑料震荡瓶中，加入80 mL 0.5mol/LK2SO4溶液(1:4水土比)，在振荡机上振荡浸提30min（25，185 rev/min）（转速根据仪器进行调整，必须使得土壤完全振荡开,过滤。4.3测定 准确吸取浸出液10.00 mL放入硬质消煮管中，加入重铬酸钾标准溶液(试剂3)5.00 mL、浓H2SO4 5mL，加入少量的抗暴物质,在170-180磷酸浴上煮沸10min，冷却后用去离子水洗涤消化管全部转移至150mL三角瓶中，总体积为70mL左右，。

9、加入2滴邻啡罗啉指示剂，用硫酸亚铁溶液(试剂6)滴定剩余的K2Cr2O7。溶液颜色由橙黄色变为蓝绿色，再变为棕红色即为滴定终点。4.4 测定土壤含水量称5.00g 上述湿润土壤，放在铝盒中，在105烘箱中烘8h，然后称其干重。5、结果计算1.有机碳(Oc)的计算W(C) =（V0-V1）×c×3×ts × 1000 /DW 式中：W(C) ¾¾ 有机碳(Oc)质量分数，mg·kg-1； V0 ¾¾ 滴定空白样时所消耗的FeSO4体积，mL； V1 ¾¾ 滴定样品时所消耗的FeSO4体积,mL； c ¾¾ FeSO4溶液的浓度,mol·L-1； 3 ¾¾ 碳(1/4C)的毫摩尔质量，M(1/4C)=3mg/mmol； 1000 ¾¾ 转换为kg的系数； ts ¾¾ 分取倍数,等于（浸提液体积+土中的水中）/吸取液的体积；