实验六 石蜡切片法1

1、实验六实验六 石蜡切片法石蜡切片法 包埋、切片和贴片包埋、切片和贴片石蜡切片法石蜡切片法o 石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既可制成可制成较薄的切片较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也，使材料各部分都清晰可见，同时也可制成可制成连续切片连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，观察材料的动态发生及层次，所以，它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握，它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握，同时也是进行透射电镜观察超薄切

2、片的基础。同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。石蜡切片的主要过程石蜡切片的主要过程o取材取材固定保存固定保存冲洗冲洗脱水脱水透明透明石蜡透入石蜡透入包埋包埋修修块块切片切片贴片贴片复水复水染色染色脱水脱水封藏封藏观察保存观察保存o（一）包埋（一）包埋o（二）修块、切片、贴片（二）修块、切片、贴片o（三）染色、封藏（三）染色、封藏一、实验目的一、实验目的o 掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求；掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求；o 熟练掌握石蜡切片的关键步骤熟练掌握石蜡切片的关键步骤包埋。包埋。o 学习旋转切片机的使用方法，熟练掌握石蜡学习旋转切片机的使用方法，熟练掌握石蜡切片的关键步骤切片

3、的关键步骤切片。切片。二、实验材料及用品二、实验材料及用品o 实验材料实验材料：植物叶片、小鼠肝脏：植物叶片、小鼠肝脏o 实验用具实验用具：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆：载、盖玻片；温箱、包埋盒、水盆等、切片机、毛笔等。等、切片机、毛笔等。o 实验药品实验药品：石蜡、蛋白黏贴剂。：石蜡、蛋白黏贴剂。三、实验步骤（三、实验步骤（1）o取材取材（根据制片目的和要求而定，代表性）；（根据制片目的和要求而定，代表性）；o杀死和固定杀死和固定：n小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成小鼠利用引颈致死法迅速杀死，取其肝脏，用生理盐水冲洗干净后分割成0.51cm0.51cm0.3

4、cm 小块投入小块投入Bouins固定液固定液中进行固定；中进行固定；n植物叶片采集后分割成植物叶片采集后分割成11.5c小块后投入小块后投入FAA固定液固定液中进行固定；中进行固定；o冲洗冲洗n小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用小鼠肝脏经苦味酸固定液固定后必须使用70%或或50%AL进行冲洗；进行冲洗；n植物叶片经植物叶片经FAA固定液后使用流水进行冲洗固定液后使用流水进行冲洗o脱水脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？目的？）n50% 70% 80% 95% 100%AL 100%ALn脱水时间：视材料的性质、大小而定脱水

5、时间：视材料的性质、大小而定n小鼠肝脏：在各级小鼠肝脏：在各级AL中停留中停留0.5-1h；n植物叶片：在各级植物叶片：在各级AL中停留中停留2-4h；n注意注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊混浊，必须倒回重脱水；如需过夜，必须倒回重脱水；如需过夜，则停留在则停留在70%酒精中。酒精中。三、实验步骤（三、实验步骤（2）o透明（置换，透明（置换，作用？作用？）n常用透明剂：二甲苯；常用透明剂：二甲苯；n透明原则：低浓度到高浓度透明原则：低浓度到高浓度 （二甲苯二甲苯+ 100%酒精酒精 二甲苯二甲苯 二甲苯）二甲苯）n透明时间：小鼠肝脏每级停留透明时间：小鼠

6、肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留；植物叶片每级停留1-3h。n脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：o（1 1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。o（2 2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。在显微镜下观察时，可见许

7、多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。o浸蜡浸蜡：n要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞要点：使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地贴在细胞壁的内外，成为不可分离的状态；壁的内外，成为不可分离的状态；n原则：低温原则：低温 高温、低浓度高温、低浓度 高浓度高浓度三、实验步骤（三、实验步骤（3）o包埋：就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸包埋：就是将已经浸好蜡的材料连用熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中，使之凝固。盒中，使之凝固。n包埋前折纸盒包埋前折纸盒n包埋时将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，包埋时将纸盒放在已经加热的温台

8、上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速且轻轻地用温镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆料，使之排列整齐。然后轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢平放于水盆的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水的水面上，待蜡盒内的石蜡表面凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边浸入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石从一边浸

9、入纸盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋块迅速凝固，待石蜡完全凝固（约蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。）后即可取出备用。包埋过程中易出现的问题及解决办法包埋过程中易出现的问题及解决办法o 问题问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出薄的切片。薄的切片。o 原因原因：组织内部或石蜡中混有透明剂；组织内部或石蜡中混有透明剂；脱水不干净；脱水不干净；石石蜡本身品质不良；蜡本身品质不良；组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡组

10、织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡已成凝固状态；已成凝固状态；冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。o 解决办法解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后二个原因者，可将包埋块再投入二个原因者，可将包埋块再投入蜡中熔化后重新包埋，但必蜡中熔化后重新包埋，但必须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。三、实验步骤（三、实验步骤（4）o修块修块：削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成面成45度的角度削去包

11、埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为形，每边的长度为0.2mm0.3mm ；n修块的目的：修块的目的：1）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲；）使切成的蜡带成一直线，不发生弯曲；2）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。）每个切片组织的距离接近，便于镜检或作连续切片。n要求要求：组织块必须组织块必须 上下平行，上下平行， 但左右的蜡、上下的蜡不要但左右的蜡、上下的蜡不要太多或太少；正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。太多或太少；正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。三、实验步骤（三、实验步骤（5）o切片：切片：用

12、锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用专门的切片机和切片刀。一般用专门的切片机和切片刀。o切片机的结构切片机的结构：n控制切片厚薄的微动装置；控制切片厚薄的微动装置；n供装切片刀的夹刀部分；供装切片刀的夹刀部分；n供装置组织块的夹物部分。供装置组织块的夹物部分。o切片机的类型根据结构分为切片机的类型根据结构分为：n滑行式切片机滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹物部分是固定的，可上：夹刀部分是滑动的，而夹物部分是固定的，可上下升降；下升降；n旋转式切片机旋转式切片机：夹物部分式上下移动，前后推进，而夹刀部分则：夹物部分式上下

13、移动，前后推进，而夹刀部分则固定不变。固定不变。三、实验步骤（三、实验步骤（6）o切片的步骤：切片的步骤：n将已经修整好的蜡块装在样品固定器上，并固定好；将已经修整好的蜡块装在样品固定器上，并固定好；n将切片刀安装在切片机的刀架上，调节切片刀的角度为将切片刀安装在切片机的刀架上，调节切片刀的角度为15左右，并固左右，并固定好；定好；n调节切片的厚度：棉花叶片：调节切片的厚度：棉花叶片：8-10um；小鼠肝脏：；小鼠肝脏：6-9um；n调节蜡块与刀口的距离：打开刀架固定钮，推动刀架，使切片刀刃贴近调节蜡块与刀口的距离：打开刀架固定钮，推动刀架，使切片刀刃贴近蜡块表面（从侧面观察），再固定刀架；蜡

14、块表面（从侧面观察），再固定刀架；n切片：打开停刀轧，开始切片，右手握住手轮柄，顺时针方向摇动，每切片：打开停刀轧，开始切片，右手握住手轮柄，顺时针方向摇动，每摇动一圈就切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时就连在摇动一圈就切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时就连在一起，连续摇转手轮就可以讲切下的蜡片练成一条蜡带。待蜡带有一定一起，连续摇转手轮就可以讲切下的蜡片练成一条蜡带。待蜡带有一定长度，左手执毛笔，将蜡带抬起，边摇边移动蜡带。待蜡带长至长度，左手执毛笔，将蜡带抬起，边摇边移动蜡带。待蜡带长至20-30cm，停止摇动，用右手执另一支毛笔顺刀口方向拔下蜡带，平放于，停止摇动

15、，用右手执另一支毛笔顺刀口方向拔下蜡带，平放于白纸上，靠刀面较光滑面向下，较皱褶的一面向上。白纸上，靠刀面较光滑面向下，较皱褶的一面向上。切片注意事项：切片注意事项：o操作时一定要小心，随时注意关好停刀轧，以防刀夹突然下降伤操作时一定要小心，随时注意关好停刀轧，以防刀夹突然下降伤及手指，在换蜡块时，必须先关停刀轧，才能取下蜡块；及手指，在换蜡块时，必须先关停刀轧，才能取下蜡块；o切片时不要对着蜡带讲话，要防风，以免将蜡带吹散；切片时不要对着蜡带讲话，要防风，以免将蜡带吹散；o根据材料要求，注意调节合适的切片厚度；根据材料要求，注意调节合适的切片厚度；o切片完毕后，将刀取下擦净，放入盒内保存，同

16、时用毛笔清洁切切片完毕后，将刀取下擦净，放入盒内保存，同时用毛笔清洁切片机各部分，将刀架、夹物器等退回原处固定。片机各部分，将刀架、夹物器等退回原处固定。切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 ：一、蜡带弯曲不直蜡带弯曲不直 n原因原因：1.蜡块上下两边不平行，或与刀口不平行；蜡块上下两边不平行，或与刀口不平行；2.刀口锋利不一，局刀口锋利不一，局部产生差异；部产生差异；3. 材料未居蜡块正中央。材料未居蜡块正中央。n补救办法补救办法： 1.取下台木，将蜡块两边修平，调节夹物部，使两者平行。取下台木，将蜡块两边修平，调节夹物部，使两者平行。2.移动刀片，改用新刀口。移动刀片，改用新刀口。3.

17、用刀片切去部分石蜡，使材料居中。用刀片切去部分石蜡，使材料居中。二、切片分离，不能连成带状或卷起成圆筒状。二、切片分离，不能连成带状或卷起成圆筒状。n原因：原因：1.室温过低。室温过低。2.石蜡过硬。石蜡过硬。3.材料边缘留蜡太少。材料边缘留蜡太少。4. 刀的角度不刀的角度不合适。合适。n补救办法：补救办法： 1.在切片机上安一盏电灯加温。在切片机上安一盏电灯加温。2.用手指在蜡块面上磨擦。用手指在蜡块面上磨擦。3.重新包埋。重新包埋。4.矫正刀的角度。矫正刀的角度。三、切片粘附于刀片上，皱褶在一起。三、切片粘附于刀片上，皱褶在一起。n原因：原因：1.室温过高。室温过高。2.石蜡过软。石蜡过软

18、。3.刀口上留有一层石蜡。刀口上留有一层石蜡。4.刀口钝。刀口钝。n补救办法：补救办法： 1.在早晚凉爽时切。在早晚凉爽时切。2.将蜡块投入凉水中稍浸。将蜡块投入凉水中稍浸。3.用二甲苯用二甲苯拭去石蜡。拭去石蜡。4.磨刀或移动刀口。磨刀或移动刀口。切片过程中出现问题的一般原因和补救办法 ： 四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。n原因：原因：1.刀口有缺口；刀口有缺口；2.石蜡块中有颗粒及杂质；石蜡块中有颗粒及杂质；3.刀口有细纤刀口有细纤丝或碎屑；丝或碎屑；4.刀和台木未夹紧；刀和台木未夹紧；5.组织块太硬。组织块太硬。n补救办补救办 法：法： 1.可移动刀片；可移动

19、刀片；2.将颗粒挑去；将颗粒挑去；3.清洁刀口；清洁刀口；4.旋旋紧螺旋；紧螺旋；5.在水中浸泡。在水中浸泡。五、材料出现裂隙、破碎或脱落。五、材料出现裂隙、破碎或脱落。n原因：原因：1.脱水不干净；脱水不干净；2.透明剂残留；透明剂残留；3.石蜡透入时温度过高；石蜡透入时温度过高；4.材料太硬或太粗。材料太硬或太粗。n补救办法：补救办法： 1.无法补救；无法补救；2.重新包埋；重新包埋；3.无法补救；如由于脱无法补救；如由于脱水剂，透明剂引起的可改用正丁醇，松油醇等进行脱水和透明；水剂，透明剂引起的可改用正丁醇，松油醇等进行脱水和透明；4.软化组织。软化组织。三、实验步骤（三、实验步骤（7）

20、o贴片：贴片：n要求要求：1）贴附牢固，在染色时不易脱落；）贴附牢固，在染色时不易脱落；2）使皱褶的蜡片伸展平整）使皱褶的蜡片伸展平整n步骤步骤：n1）在载玻片上涂上蛋白黏贴剂；）在载玻片上涂上蛋白黏贴剂；n2）将已经涂好蛋白黏贴剂的载玻片放在纸面上，并滴加数滴蒸馏水；）将已经涂好蛋白黏贴剂的载玻片放在纸面上，并滴加数滴蒸馏水；n3）用刀片将蜡带切成许多小段，每段的长度应依照盖玻片的长度为准，）用刀片将蜡带切成许多小段，每段的长度应依照盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约一般应比盖玻片短约1/5-2/5，因蜡片加温后要伸长，因蜡片加温后要伸长1/5-2/5，在分段时应，在分段时应从蜡片的交界处

21、分开；从蜡片的交界处分开；n4）用毛笔将蜡片轻轻移到载玻片上（必须注意蜡片的光面朝下）；）用毛笔将蜡片轻轻移到载玻片上（必须注意蜡片的光面朝下）；n5）将载玻片平行地放置在酒精灯的上方，微热，使切片伸展摊平，如）将载玻片平行地放置在酒精灯的上方，微热，使切片伸展摊平，如发现散开，请重新用镊子排列整齐；发现散开，请重新用镊子排列整齐；n6）晾干待用。）晾干待用。四、实验结果四、实验结果o 包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有气泡。气泡。o 包埋材料摆放的位置是否符合要求？包埋材料摆放的位置是否符合要求？o 修块效果修块效果：每个蜡边与材料平行，

22、蜡边的上下左右摇平：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇平行。行。o 切片效果切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。o 展片效果展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢固，：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。五、作业五、作业o 实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写上材料名称及自己的姓名和日期；上材料名称及自己的姓名和日期；o 实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻片上写上材料名称及自己的姓名和日期；片上写上材料名称及自己的姓名和日期；o