苏教选修植物组织培养技术实用教案

1、一、实验(shyn)目的掌握植物组织培养相关理论知识掌握植物组织培养的操作方法了解不同激素(j s)及其比例对愈伤组织再分化的作用第1页/共46页第一页，共46页。二、相关(xinggun)(xinggun)知识 离体（in vitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定(dindng)了基础。 第2页/共46页第二页，共46页。应用领域应用领域 1 1、快速繁殖、快速繁殖 运用组织

2、培养的途径运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到。例如一株兰花一年繁殖到400400万株。万株。2 2、种苗脱毒、种苗脱毒 针对针对(zhndu)(zhndu)病毒对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。效地培育出大量的无病毒种苗。3 3、远缘杂交、远缘杂交 利用组织培养可以使难度利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。的新物种。二、相关(xinggun)知识第3页

3、/共46页第三页，共46页。应用领域应用领域 4 4、突变育种、突变育种 采用组织培养可以直采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。蛋白等优良性状的品种。5 5、基因工程、基因工程 基因工程主要研究基因工程主要研究DNADNA的的转导转导(zhun do)(zhun do)，而基因转导，而基因转导(zhun (zhun do)do)后必须通过组织培养途径才能实现植株后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。再生。6 6、生物制品、生物制品 有些极其昂贵的生物制品有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物，如抗癌首选药物-

4、紫杉醇等，可通过组织培紫杉醇等，可通过组织培养方式生产。养方式生产。二、相关(xinggun)知识第4页/共46页第四页，共46页。植物组织培养的分类 广义(gungy)的组织培养依外植体不同，可分为： 1) 器官培养（organ culture） 2)茎尖分生组织培养(shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈伤组织培养(calluse cultrue) 4)细胞培养(cell culture) 5)原生质体培养(protoplast culture)二、相关(xinggun)知识第5页/共46页第五页，共46页。 外植体(explant)

5、：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。 愈伤组织(callus)：在人工(rngng)培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。二、相关(xinggun)知识第6页/共46页第六页，共46页。二、相关(xinggun)知识第7页/共46页第七页，共46页。二、相关(xinggun)知识第8页/共46页第八页，共46页。二、相关(xinggun)知识第9页/共46页第九页，共46页。二、相关(xinggun)知识第10页/共46页第十页，共46页。二、相关(xinggun)知识第11页/共46页第十一页，共46页。二、相关(xinggun

6、)知识第12页/共46页第十二页，共46页。植物组织培养特点 培养条件可以(ky)人为控制 生长周期短，繁殖率高 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制二、相关(xinggun)知识第13页/共46页第十三页，共46页。植物组织培养营养(yngyng)条件-培养基(Culture Medium) 培养基是植物组织培养的重要基质。 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。二、相关(xinggun)知识第14页/共46页第十四页，共46页。 国际上流行(lixng)的培养基有几十种，常用的培养基有： MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-

7、8P培养基二、相关(xinggun)知识第15页/共46页第十五页，共46页。常用培养基简介-MS培养基 1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他(qt)培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。二、相关(xinggun)知识第16页/共46页第十六页，共46页。常用培养基简介-B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有(hn yu)较低的铵，这可能

8、对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。二、相关(xinggun)知识第17页/共46页第十七页，共46页。常用培养基简介-White培养基 是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机(wj)机盐数量较低，适于生根培养。二、相关(xinggun)知识第18页/共46页第十八页，共46页。常用培养基简介N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计(shj)的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

9、在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。二、相关(xinggun)知识第19页/共46页第十九页，共46页。常用培养基简介KM-8P培养基 1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛(gungfn)地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。二、相关(xinggun)知识第20页/共46页第二十页，共46页。不同营养条件对植物(zhw)组织培养的影响 Growth medi

10、um is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%T h e e x p l a n t i s completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.Shoots developed o

11、n edges of upper surface, a n d s o m e r o o t development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium二、相关(xinggun)知识第21页/共46页第二十一页，共46页。No BAPBAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot

12、development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undi

13、fferentiated callus is developing at the edges of the explant二、相关(xinggun)知识第22页/共46页第二十二页，共46页。NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from explant at all. MS salts reduced to 0.

14、47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.二、相关(xinggun)知识第23页/共46页第二十三页，共46页。植物(zhw)细胞的全能性 植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。 差异:(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在

15、全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用(zuyng)下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。三、实验(shyn)原理第24页/共46页第二十四页，共46页。植物(zhw)细胞全能性的表达 脱分化（dedifferentiation)：将来自(li z)已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。三、实验(shyn)原

16、理第25页/共46页第二十五页，共46页。四、试剂(shj)和器材1、材料 新鲜胡萝卜茎2、试剂(shj) MS培养基 10%亚硫酸溶液第26页/共46页第二十六页，共46页。MS培养基配制(pizh)方法四、试剂(shj)和器材第27页/共46页第二十七页，共46页。四、试剂(shj)和器材3、仪器(yq)高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱4、玻璃器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿5、用具镊子、解剖刀、接种针、记号笔、封口膜第28页/共46页第二十八页，共46页。离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织(zzh)、细

17、、细胞胞脱分化(fnhu)愈愈伤伤组组织织(zzh)再分化根根芽芽植植物物体体五、操作步骤第29页/共46页第二十九页，共46页。五、操作步骤 切开胡萝卜，在圆圈(yunqun)处取一块组织 P-木质部、C-形成层、X-韧皮部第30页/共46页第三十页，共46页。五、操作步骤形成(xngchng)层开始形成(xngchng)愈伤组织C1-愈伤组织、C2-形成(xngchng)层第31页/共46页第三十一页，共46页。五、操作步骤3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化(fnhu)）组织块失去色素第32页/共46页第三十二页，共46页。五、操作步骤把脱分化后的愈伤组织(zzh)转移到培养基上第33

18、页/共46页第三十三页，共46页。五、操作步骤两周左右(zuyu)开始再分化，长出幼苗第34页/共46页第三十四页，共46页。五、操作步骤将幼苗移植(yzh)到外部条件下培养（顺化）第35页/共46页第三十五页，共46页。五、操作步骤顺化(shn hu)一个月后的胡萝卜植株第36页/共46页第三十六页，共46页。培养基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)： 按照MS培养基成分表, 配制分别配制培养基的母液。1、大量元素母液(10倍液) 分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80）蒸馏水中。（一种成分完全(wnqun)溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1

19、000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。五、操作步骤第37页/共46页第三十七页，共46页。2、微量元素母液(100倍液) 分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解(rngji)于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。 3、铁盐母液（100倍液） 称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO47H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。 五、操作步骤培养基配制(pizh)(I )母液配制(pizh)：第38页/共46页第三十八页，共46页。4、有机物质母液(100倍数) 分别(fnbi)称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容

20、至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。 除上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。五、操作步骤培养基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)：第39页/共46页第三十九页，共46页。5、生长素 如2,4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用(biyng)。 6、细胞分裂素 如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/ml HCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用(biyng)。五、操作步骤培养基配制(pizh)(I)母液配制(pizh)：第40页/共46页第四十页，共46页。 取1000ml烧杯一只，加大量元素(yun s)10倍母液100ml，微量元素(yun s)100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L 的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。五、操作步骤培养基配制(