食品微生物学实验综合性实验指导-细菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定

1、实验一、大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定（综合性实验）（一）目的1. 通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本 实验技能。2. 巩固培养基的配制、火菌、仪器的包扎、倒平板。3学习用比浊法测定细菌的生长曲线。4.比较不同培养基的半长曲线（二）原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一 定时间测定培养液屮的菌量，以菌量的对数作纵处标，生长时间作横处标，绘制的illi线叫生 长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体牛长规律。 依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数生长期、稳定期和

2、衰亡期。这 4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而冇所不同。因此通过测定微生 物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具冇重要的指导意义。测定微牛物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊 法测定，山于细菌悬液的浓度与光密度（0d值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬 液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的0d值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌 在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。（三）材料1. 菌种：大肠杆菌（escherichia coll2. 营养琼脂培养基：根据产品说明配制3. 生理盐水（0.9%nacl） looml,分装

3、入10支试管（每支9ml）4. 培养基：本实验采取正交实验确定大肠杆菌最优的生长条件，采取53"正交衣，正 交设计如下：表头（53、序号1234医紊名称醉爭青濟弐拣nacl芸载呈/远水平10-4%0.8%0.8$20水平20.s%0.9%0.9%25水平30."1%1%30实验设计:因素酵母音蛋白陈nacl装载s/ml实验10.4n0.80.820实验20.4之0.90.925实验30.4%1之1之30实验40.5之0.80.9之30实验50.5玄0.9玄1鬼20实验60.5之1%0.8之25实验70.60.8%1之25实验80.60.3%0.8之30实验90.6鬼1玄0.

4、9鬼20培养基经121°c灭菌20mino5仪器及其他用品721型分光光度计、比色杯、恒温摇床、培养箱、高压灭菌器、电了天平、ph计、酒 精灯、电炉、接种环、试管架、培养皿10个、无菌吸管（lnil） 10支、烧杯、试管、锥形 瓶12个（250ml）、胶头、牛皮纸、硅胶塞等。（四）流程种子 标记 接种一*?养伍）步骤1 标记编号按要求配制培养基，将无菌培养基装于10个250ml锥形瓶，分別编号为oh, 4h, 6h,8h, llh, 14h, 16h, 18h, 19h, 21h。2. 接种培养（1）种子液制备：取大肠杆菌jeschorichia coli）斜而菌种一支，用接种环刮取

5、少量细菌于纶理盐水 （或无菌水）中，用胶头滴管震荡均匀。（2）摇床培养：用lml无菌吸管分别准确吸取iml种子液加入己编号的9个三角瓶小，于37°c下在恒 温摇床上培养（180r. min1）（以上步骤均需在无菌操作台上操作）。然后分别按对应吋间将 三角瓶取出，立即放冰箱中（2-4°c）贮存，待培养结束时一同测定0d值。3. 生长量的测定将未接种的培养基倒入比色杯中，选用640nm分光光度计上调节零点，作为空口对照, 并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用耒接种的培养基适当稀释后 测定，使其0d值在0.1-0. 65 z间，经稀释后测得的0d值要乘于稀释倍

6、数，才是培养液实 际的od值。4. 对第16h的培养液进行倒平板。（六）生长曲线的比较对所得数据进行生长dii线的绘制，比较各组培养基生长曲线上最人吸光度，（七）思考题1. 刚买来的菌种一般是冻干菌，应如何接种到斜面？2. 在培养基调pll时应选用什么试剂?3. 在接种培养时，对应时间取出三角瓶后，为什么要立即放到冰箱屮贮存？4. 正交试验设计屮，应如何进行数据处理分析？正交试验是如何确定最住住长条件？实验七多聚磷酸盐与大豆蛋白的保水性研究（一）实验目的1. 了解提高保水率的原理和方法。2. 掌握多聚磷酸盐和大豆蛋白提高保水率的机理。3 掌握正交实验的方法。（二）实验原理1. 磷酸盐对肉制品保

7、水性的影响磷酸盐肉制甜中应用的磷酸盐结构基木相似，是山一个或多个磷酸盐单元连接成的，常用 的几种磷酸盐有三聚磷酸盐，焦磷酸盐，六偏磷酸盐，正磷酸盐等。除了焦磷酸盐外，其他 的磷酸盐都是屮性或屮性偏碱的，磷酸三钠不能在肉制品屮应用，磷酸钾价格较高且易吸潮, 也较少使用。磷酸盐的加入一般是先配制成溶液，根据不同需耍采取直接加入或注射加入，其 最大添加量为0.5% o不同磷酸盐改善制品的效果不同，其改善效果为:焦磷酸盐三聚磷酸 盐六偏磷酸盐二正磷酸盐，磷酸盐的效果普遍优于其他盐类，但两者并用时，效果具冇协同性， 磷酸盐可以改善肉制品的功能特性。减少颜色风味的败坏，它改善肉制品功能特性的机制和 其他盐

8、类相似，从肉屮提取肌原纤维蛋白，加热时蛋白质相互作用，形成一个强而冇序的三维 立体网状热固定结构，这种纤维蛋白晶格结构把小肉块粘结在一起冲间的缝隙束缚水分，从 而提鬲了肉制品的保水性。许多学者认为磷酸盐作用效果好于其他盐类是因为磷酸盐能提高 肉制品的ph值，促进肌原纤维蛋白的提取，增强了热固定结构的强度，焦磷酸盐能离解肌动 球蛋口（一种主要的肌原纤维蛋口），增加了肌原纤维蛋口的提取。另外,磷酸盐还能延长肉制 甜的货架期，主要是因为磷酸盐能减少色素和脂类的氧化,研究人员认为磷酸盐能螯合自山离 了（一种氧化强化剂），这样就降低了肌球蛋白的氧化，从而减少颜色和风味的败坏。虽然磷酸 盐是一种很有用的添

9、加剂,但添加量不丿应超过（）.5%,磷酸钠处理的肉有甜味，偏磷酸钠处理的 肉有涩味等，且当其用量大于0.3%吋，就会有金属味。而且经常使用磷酸盐含量高的肉制站, 体内磷酸盐的不断积聚会影响钙的吸收，容易导致骨质疏松症。冃前，大多数肉制品小磷酸盐 的含量控制在0.2%0.3%,既安全,又能改善肉制品的各项功能特性。磷酸盐是肉制品的一种冇效的保水剂。生产中大多使川碱性磷酸类.其中以焦磷酸钠、三 聚磷酸钠和六偏磷酸钠为最好。其保水机理可从以下几方面考虑：捉高肉ph。磷酸盐呈碱性，可使肉的ph向碱性偏移.远离蛋口质等电点.从而提高肉的 保水性。与肌肉屮金属离鳌合。加入磷酸盐麻.原来与肌肉屮结构蛋白结合

10、的ca2+、mg2+可被 聚磷酸盐鳌合，蛋自质释放出竣基。市于竣基同性电荷相斥作用，使蛋口质结构松驰，可吸 收更多的水分。增加肉离子强度。磷酸盐溶液中的高价阴离了可增加肌肉的离子强度.冇利于肌球蛋白b 转变为溶胶状态.亲水性增强。解离肌动球蛋口。磷酸盐将肌动球蛋白解离为肌球蛋口和肌动蛋a肌球蛋白的增加也可 使肉的保水性提高。抑制蛋白质变性。肌球蛋白是决定肉保水性的重要因素但对热不稳定在盐溶液屮3（）°c 就开始变性保水能力降低而焦磷酸盐对肌球蛋白的变性冇一定抑制作用可使肌肉蛋白质 的保水能力稳定。偏磷酸盐在煮制时能加速蛋匚i质的胶凝作用。表血的蛋白质一经凝固肉制品内部的水不 易渗透出

11、来而被包裹在网络中。丨1前我国允许使用的磷酸盐主要有三聚磷酸钠、六偏磷酸钠和焦磷酸钠三种。磷酸盐混 介使用效果比单独使用要好其配比一般为21%六偏磷酸钠.37%三聚磷酸钠.42%焦磷酸钠 （也有报道二者依次为30% , 22% , 48%时效果好），使用量一般在0.1-0.4%o2. 大豆蛋白对肉制甜保水性的影响大豆蛋白含有丰富的蛋白质（7（）%）和对食性纤维素（22%）,具有较高的营养价值。大豆蛋白 不仅能够提高肉制品的保水性、乳化性和风味，而且还供给人体必须的全部氨基酸，从而提高 肉制品的营养价值。人豆蛋口提高肉制品持水性的原因z是人豆蛋口吸水后（吸水比为1 : 3）,颗粒分散得更小,再配

12、以滚揉、挤压、搅拌等工艺，则颗粒更接近分子化,在一定ph条件下, 带电的蛋口质分子被极性水分子包裹起來，形成稳定的结构,并能和英他添加料、浸出物形成 凝胶。另一个原因是大豆蛋白分子遇水后，起膨润作川，使具网状结构松驰，较多的水分和脂肪 被包裹在网络屮,使肉制品的保水力提|'曲o肉制品生产中一般在滚揉的最后阶段（如盐水火腿在滚揉结束前15分钟加入）或拌馅（如 灌肠）时加入大豆蛋白。如果距离煮制或烘炜的吋间太短，大豆产品蛋白粉难以达到最大膨润 度。如果条件允许贝冋在冷库内存放一仅以给予足够的膨润时间，次li稍加滚揉、搅拌即可。 大豆蛋白质的添加量一般为原料肉的1.5%-2.5%o（三）实验

13、材料、仪器与试剂1材料：新鲜精猪瘦肉、肥肉、淀粉、盐、味精、胡椒粉。2.试剂：spp/焦磷酸钠（分析纯）、stp/三聚磷酸钠（分析纯）、shmp/六偏磷酸钠（分 析纯）.大豆蛋口（食用级）3主要器材仪器：绞肉机，恒温水浴箱，电子天平，电子分析天平，恒温t燥箱， 称量瓶，冰箱（四）配方与工艺流程1 配方所有配料按瘦肉100%比例算。瘦肉100%、肥膜10%、食盐2.5%、生粉7%、胡椒粉0. 95 %味精0.5%、冰（冰屑）15%o2.工艺流程5%冰水，复合磷酸盐，生粉肥膘，味精i瘦肉一绞肉（加食盐,10%冰水）一 斩拌40-60（min）- 成型（80°c）-冷切一 切块一称量f干燥

14、一称至恒重3 .制作猪肉丸的工艺说明：配比绞肉前应称好所需的材料和试剂，按瘦肉100%比例算。绞肉，瘦肉应先用食盐腌卜分钟，然示放入绞肉机里绞碎，一边绞肉一边加冰屑（10%） 以维持低温，瘦肉绞两次，肥肉绞一次.斩拌绞肉完毕，加如味精，胡椒粉等调味料。搅拌十分钟（混匀），加入淀粉搅拌3045分钟, 在此期间一边搅一边加入剩余的冰水（5%）o斩拌过程须严格控制斩拌温度，防止肉温升高。 因此，在实践过程屮，通常以加冰屑代替水，以维持低温（8°c以下）。开始掺水时，应慢而 少，再分次加入，逐步增加。搅拌时，速度应由慢到快，用力由轻到重，让肉糜逐步上劲。 最后加入肥肉搅拌15分钟。挞拌至起胶

15、。成型条件可用肉丸成型机成型，此实验川手捏成型，成型后放入80°c的恒温水浴屮维持15-20 分钟，使肉丸中心温度达到70-72°c是较理想温度，此时蛋白质既不会急剧收缩而严重脱水, 又可达到熟制的目的。冷却成型后的肉丸应静置20-30分钟冷却，使其表面的热水蒸汽蒸发干。切块将肉丸的表面切去,取其中间一小块2x2cm （以放得下称量瓶为准）,放入称量瓶中。 称量称量过程使用电子分析天平，事先应称好称量瓶的重量，然后称出肉丸片与称量瓶的重 量。干燥，放入80°ctu温干燥箱，干燥6个小时。恒重从恒温干燥箱取出肉丸片与称量瓶，称其重量，放回恒温干燥箱干燥半小吋，前后重

16、量 差小于2吨,即为恒垂。4.注意事项：（1 ）如不用机制，用手工搅拌必须顺着同一方向，先慢后快，切忌倒顺不一，快慢不 均，要先搅拌，后挞拌至起胶。（2）绞肉过程应注意安全，绞肉时应使用用绞肉机配置的鴉料棒将肉捅入绞肉i i而勿 使用药勺等其他器貝，以免被绞肉机打断伤人。绞肉机工作时千万勿将手伸入绞肉口。用完 应及时断电，保证安全。（五）保水率的测定方法干燥前称量瓶与肉丸片总重一干燥后称量瓶与肉丸片总重保水率 whc（ % ）= x 100%t燥前称量瓶与肉丸丿v总重一称量瓶重（六）操作方法及计算表1大豆蛋白最佳用最的确定、量数据 、0.5%1.0%1.5%2.0%2.5%3.0%123（2）复介磷酸盐最佳配比的确定选用l9（34）正交表，进行正交组合试验。各单因素水平见表2表2.各单因素水平表水平因素a (%) stpb (%) sppc (%) shmp10