蛋白质间相互作用研究方法--技术流

1、蛋白质间相互作用研究方法确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质. 双杂交和其他双成分系统第一阶段：诱饵 -LexA 融合蛋白的鉴定诱饵 -LexA 融合蛋白的构建1. 将编码诱饵蛋白的靶 DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的 LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait 。2 .采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ 报道质粒的组合，建立一系列EGY48lexAop-LEU2 选择的转化酵母菌：a. pBait + pMW12 （活化测定）b. pSH17-4 + pMW12 （活化的阳性对照）c. pRFHMI + pMW

2、12 （活化的阴性对照）d. pBait + pJK1O1（抑制 /DNA结合测定）e. pRFHM1 + pJK101 （抑制的阳性对照）f. pJK101 单独（抑制的阴性对照）3. 将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM（Glu）-Ura-His （针对质粒组合 ae） 或CM（Glu）-Ura （针对质粒组合f ）。将培养板在37C培养23天以选择含有质粒的转化 酵母克隆。4. 制备转化子的母板。活化和抑制活性的鉴定： X-gal 和 Leu2 表型的分析5. 从 af 的每个转化中， 用无菌的平头牙签挑选约 8 个克隆。 用干净的牙签触及克隆以挑取细胞，使它们在新鲜的CM（G

3、lu）-Ura-His 或CM（Glu）-Ura平板上划1 cm长的线，30C孵育过夜。6. 第二天，从两个母板上再划线到下列每个板上： 转化 af:划线到 CM(Glu, X-gal)-Ura 和 CM(Gal, X-gal)-Ura 上 转化 ac：划线到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu7. 30 C将平板孵育到4天。8 对抑制和激活性进行分析：a. 对于抑制活性，在划线接菌1224 h时观察X-gal表型。b. 对于激活性，在划线接菌1872 h时观察X-gal表型。c. 在 48 96 h 之间观察 Leu 表型。9基于抑制和激活分析

4、的结果，选择适当的候选克隆。检测诱饵蛋白质表达10 在母板上，标记要分析蛋白质表达的克隆。用已证实适宜表达诱饵的克隆作为基础菌 培养，供文库转化用。11 对每个新的诱饵构建，至少分析两个初级转化子。还要包括两个作为蛋白质表达阳性 对照的转化子。12 转移 1.5 ml 培养液到一个微量离心管中，在离心机上以最大速度离心细胞35 min 。可见沉淀的体积 25卩l。小心倾去或吸除上清。13. 加入50卩l的2X SDS凝胶加样缓冲液到离心管中，快速振荡离心管以悬浮沉淀。立 即将离心管放在干冰上或干冰 / 乙醇浴中。14. 将样品从干冰或-70 C直接转到100C，并煮沸5 min。15. 将样品

5、在冰上冷却并在离心机上以最大速度离心530秒。加2050卩l样品到SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中。16. 电泳并分析产物以确定预期大小的诱饵蛋白是否以合理的水平表达。17. 为防止可能出现的问题，通过免疫印迹来分析含 LexA 融合的诱饵的酵母裂解液。第二阶段：筛选一个相互作用子转化文库1. 挑选一个在第一阶段的原始对照试验中状态最好的表达诱饵蛋白和lexAop-lacZ 报道子的酵母菌落，接种于 20 ml CM(Glu)-Ura-His液体培养基中，30C摇动过夜培养。2. 稀释20 ml的过夜培养物于 300 ml的CM(Glu)-Ura-His 液体培养基中至 OD60哟为0.10

6、 0.15。在旋转摇床上 30C摇动培养，直到 OD600达到0.50左右。3. 把培养物转移至 1个250 ml的无菌离心瓶中，室温下10001500g (使用Sorvall GSA 转子25003000 r/min )离心5 min。移去上清，加入 30 ml无菌水，在工作台上轻 轻拍打离心瓶重新悬浮沉淀，转移混合物至 1 个 50 ml 的无菌 Falcon 管中。4. 10001500 g (同上)离心酵母细胞 5 min。倒掉水，重新悬浮酵母细胞于1.5 ml含0.1 mol/L 乙酸锂的 TE(pH 7.5) 中。5. 在30个1.5 ml的无菌小离心管中分别加入1卩g的文库DNA

7、和50卩g刚刚变形的载体DNA马上在每个小离心管中加入50卩l的酵母悬浮液。6. 在每管细胞悬浮液中加入300卩l含40%PEG4000和0.1 mol/L乙酸锂的无菌 TE(pH 7.5), 混合(不要振荡)，30C培养3060 min。7. 每个试管中加入 40卩l DMSO,翻转混匀悬浮液，在42 C的加热块上加热 10 min。8 转化混合物铺平板：其中的28管用于产生转化子：把每管混合物加到24cmX 24cm的CM(Glu)-Ura-His-Trp选择平板上，将细胞涂匀，将板30C孵育至菌落出现。剩余2管：每管取 350 l混合物加到24cmX 24cm的CM(Glu)-Ura-H

8、is-Trp 选择平板上，30C培养平板至出现菌落；吸取每管剩余的40卩l混合物用无菌的TE(pH7.5)或水做一系列的1: 10稀释，每份稀释液取 100卩l取在100 mm CM(Glu)-Ura-His-Trp平板上，30C培养平板至出现菌落。初级转化子的收获和富集9. 通过摇动法或刮擦法收获文库。10. 如果需要，在每个装有酵母细胞的锥形管中加无菌TE ( pH7.5)或无菌水至4045 ml, 振荡或翻转试管悬浮细胞。11. 使用台式离心机 1 0001 500g 室温下离心试管 5 min ，弃去上清。12. 重复步骤 10 和 11。13. 重新悬浮压紧的细胞沉淀于一倍体积的无菌

9、甘油溶液中，合并不同管的内容物，彻底 混合。14. 分别转移1 ml的细胞混合物于一系列无菌小离心管中，-70 C冻存。相互作用蛋白的筛选15 解冻一份转化文库酵母细胞(来自步骤14)，用 CM(Gal-Raff)-Ura-Trp 培养基按 1 ：GAL1启动子的转录。10稀释，30 C摇动培养酵母细胞 4 h来诱导文库中16 在适当数量的 100 mmCM(Gal-Raff)-Ura-Trp-Leu dropout 平板上分别培养 106 个细胞。17. 30 C培养平板5天。18 观察平板的生长，出现克隆时对其加以标记。19. 第 5 天，形成一个按每天出现的不同克隆分组的主板。20. 3

10、0 C孵育平板直到斑点/菌落形成。阳性相互作用的初次确定：3-半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求的检测21 . 测定转录活性。22. 解释结果。第三阶段：阳性相互作用的再次确定阳性质粒的分离1.从阳性菌落中制备细胞裂解物：分离少量的菌落时，将细胞在SDS中裂解；分离大量的菌落时，细胞用酶解酶裂解。转化至大肠杆菌中2 .通过电穿孔的方法在感受态大肠杆菌DH5z或菌KC8中引入15卩I的质粒DNA制备品，把细菌铺在含有50卩g/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，37C孵育过夜。3 .如果质粒DNA转入DH5a中，则进行步骤4，如果转入KC8贝V：在LB/氨苄青霉素瓶板上重新划线培养，或复制平板将菌落转移至细菌

11、用基础培养基，37 C孵育过夜；从一个分离的菌落制备小量的DNA按步骤2所述利用这些DNA转化细菌DH5a细胞。4 .从携带文库质粒的 DH5a细胞制备小量的DNA5.通过对含有相同插入片段的阳性克隆制备的重复样品来进行限制性酶切分析确证或确定 是否重复分离到了小量的 cDNAs。阳性相互作用的第二次确证：重复表型和特异性检测6 .用下面的几组质粒转化酵母株EGY48在CM(Glu)-Ura-His 平板上筛选菌落。a. pMW112 和 pBaitb. pMW112 和 pRFHM-1c. pMW112 和一个非特异性诱饵蛋白72至 3天后就可以使用由步骤 6所得的转化酵母。使用电穿孔的方法

12、把得自大肠杆菌 KC8 和DH5a的质粒引入单个的转化子ac中。把转化混合物铺在CM(Glu)-Ura-His-Trp 平板上，30C孵育平板直至菌落长出。8为每个需要检测的文库质粒制作一块CM(Glu)-Ura-His-Trp 主板。9 如第2阶段步骤21所述，检测3 -半乳糖苷酶活性和亮氨酸营养缺陷型。10 分析这些特异性检测的结果，并对所得阳性分离物进行测序。.用GST融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白质-蛋白质相互作用放射标记蛋白探针的制备1 在微量离心管中制备下列反应混合物：丫 -32P ATP (6000 Ci/mmol ) 5 卩 l蛋白激酶A 1 unit/ 卩l

13、在谷胱甘肽琼脂糖上的GST融合蛋白13卩g2 X PK缓冲液12.5卩l水到25卩l反应混合物在37C孵育30 min。2 标记反应完成后，加入200卩l的1X PK缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心 1 min 。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复 清洗一次。3 用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用20mmol/L还原型谷胱甘肽于 50mmol/L Tris (pH8.0)中，将标记GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。4 在标记反应前如果标记蛋白与GST成分分开，就将标记蛋白上用1 X PK缓冲液平衡的Sephadex

14、 G-50 柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。 将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。探测膜5用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。6.用碱性缓冲液完全覆盖膜并在4C轻轻振荡清洗10min。7 .弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在4C轻轻振荡孵育4h过夜。8 加入13卩g的贮存探针(步骤 3, 4)到足够的相互作用缓冲液中，使终浓度为15nmol/L ，制备标记蛋白溶液。将膜转移到含稀释探针的平皿中，确认探针溶液与膜的整个表面均匀接触。4C轻轻振荡孵育45 h。9. 以适当的方式弃去放射性探针溶液。用磷酸缓冲盐溶液(含0.2% Triton X-1

15、00 )完全 覆盖膜，并在4C轻轻振荡孵育10 min。重复洗涤3次。10. 用磷酸缓冲盐溶液(含 0.2% Triton X-100 和 100 mmol/L KCl )完全覆盖膜，并在 4 C轻轻振荡洗涤10 min。重复洗涤1次。11. 用塑料包膜小心包裹膜并曝光到X光片上。相互作用在生理上的证实和探索. 通过免疫共沉淀确定结合蛋白1 .用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷 的EBC裂解缓冲液中。2 .将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4C以最大速度离心15 min。3 .收集上清(约30 ml )并加入30卩g

16、的适当抗体，4C摇动免疫沉淀物1 h。4 .加入0.9 ml的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4C摇动免疫沉淀物 30 min。5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN 洗一次。6 .吸出混合物的液体部分。加入800卩l的1 x SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。7 .将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次 3 min。10. 用胰蛋白酶消化胶

17、中的蛋白质，再将肽电洗脱。11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动 Edman降解测序。快速分析过去已确定的相互作用利用 BIAcore 通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质RAMcc!过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合I. 将CM-5传感芯片模块嵌入 BIAcore仪器。2 .全部采用过滤并除气的 HEPES缓冲盐溶液。3. 将分别含有 NHS EDC乙醇胺和 RAMFc以及20 mmol/L HCl各100卩I的小管置于 BIAcore 自动进样器架的适当位置。4. 将一个空管置于 BIAcore 自动进样器架上。5 .开动仪器，以5卩l/min的流速流过一个流动池。6. 将75卩l的NHS加入到一个空管中。7 .在同一个管中再加入 75卩l的EDC8将含有NHS和EDC的小管中的成分混匀。9 .注射35卩l NHS/EDC混合物使表面活化。10. 注射35卩IRAM Fc到活化表面与抗体结合。II. 注射35卩l乙醇胺使过量的反应基团失活。12. 快速注射10卩l的20 mmol/L HCL，然后用Extraclean