酚氯仿异丙醇抽提核酸的一些问题

1、酚：氯仿：异丙醇抽提核酸的一些问题2014-01-4 23:191. 异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别 ：异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀， 因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下 游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水， 所以能去掉一些盐离子。有时还用 70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙 醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白

2、污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用异丙醇：优点为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.541.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA;但对5sRNA、 tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类(如 NaCI、蔗糖)与 DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除 去，所以常规需要用 70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处

3、，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀 DNA，对于RNA则需要将乙 醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。需在 -20放置很长时间，30分钟-1小时。同样需 要70%乙醇洗涤。2. 一般用的是 酚：氯仿：异丙醇为 25： 24： 1 (v/v )，其中酚是强烈的蛋白质变性剂， 能有效使蛋白质变性而除去，氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，3. 本身酚：氯仿：异戊醇 =25： 24： 1的主要作用是抽提蛋白质步骤：质粒用 等体积 的酚1/10 体积的 3 mol/L/氯仿/异丙醇抽提一次，重复此步骤，加入两倍体积的无水乙醇和乙酸钠溶液后混匀，零下20摄氏度沉淀30

4、 min后12000 r/min离心10 min，沉淀用75%乙醇洗涤一次，12000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀自然干燥后溶于2040微升去离子水中或者 0.5 mol/L pH8.0的TE中。4.酚/氯仿法提取DNA的原理1）酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分 poly （A） RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。

5、2 ）氯仿的作用：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的过量酚。（酚易溶于氯仿中）3） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚 嬴仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4）用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc, Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。5）酚氯仿法提

6、取 DNA的一些试剂的作用酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞 DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点:1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用。缺点：1.能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly （A） RNA。2.不能完全抑制 RNase的活性。'氯仿的作用?L j氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组

7、 DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么?异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产 生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？/用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCI或NaAc, Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如 1mol/L氯化钠），但在O.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核塁酸核蛋白（R

8、NP）则在O.14mol/L氯化钠中溶 解度最大，利用这一性质可将其分开。将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS溶液，使 DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1moI/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用L 95%乙醇沉淀DNA。溶解：将离心后除去 RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10% SDS溶液，使溶液的 SDS浓度达到1 %左右，边加边搅拌，放置60 C水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；除杂质：加等体积氯仿-异戊

9、醇混合液，充分震荡10分钟，8000 r/min离心7分钟，取上层液,量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止；沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95%冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解，得DNA溶液。L溶液I溶菌液:溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的3 -1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透

10、压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA ( 1)螯合Mg2 +、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基)；(2) EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液 II NaOH SDS液：NaOH:核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH > 12或pHv 3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1 /L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体 DNA与质粒DNA的变性。SDS SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：

11、(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2 )解聚细胞中的核蛋白。(3) SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3 R+ -蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下 一步操作中(用 RNase去除RNA时)受到干扰。溶液 lll-3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用 pH4.8的NaAc溶液是为了把 pH12.6的抽提液，调回 pH至中性，使变 性的质粒 DNA能够复性

12、，并能稳定存在。而高盐的3mol /L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而 互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 1为什么用无水乙醇沉淀 DNA?.用无水乙醇沉淀 DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使 DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与 D

13、NA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95 %乙醇昂贵）。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 15 30分钟即可。在用乙醇沉淀 DNA时，为什么一定要加 NaAc或NaCI至最终浓度达 0.10.25mol/L ?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCI

14、,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少 DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成 DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？丿加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加 SDS可使它们成为SDS蛋白复合物沉淀，再力口 KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱

15、和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNasa在溶液中，有人以 KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。f7 .为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用 TE缓冲液?<>在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa= 7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生 理范围（pH），可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离 子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCI （pKa=8.

16、0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用 Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用f>抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水 的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中， 各有利弊，

17、酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混DNA蛋白酚与氯仿溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水 相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。 也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。为什么用酚与氯仿抽提 DNA时，还要加少量的异戊醇?在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气 泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提

18、产生。一般采用氯仿与异戊醇为24: 1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25 : 24:1 （不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24: 1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1 ?抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？i；酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间 的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水 的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶

19、剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中， 各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水 相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。为什么用酚与氯仿抽提 DNA时，还要加少量的异戊醇?在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少扌产生。一般采用氯仿与异戊酵为24: 1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25 : 24:1 （不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24: 1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶 齐U