酚试剂法测定蛋白质含量试验报告

1、生物化学实验报告姓 名：学 号:专业年级:组 别=第七实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin 酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点第七实验室合作者指导老师教师签 评分名批改日期格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，15倍行距；数字、英文用Times NewRoman；标题用:号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、学握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。2、熟悉分光光度计的用法。3、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。二、实验原理1、双缩服反应：在碱性溶液中，双缩嫌能与C

2、U2+作用，形成紫红色的络合物,而蛋白质分子中含有与双缩服结构相似的多个肽键，在与碱性铜试剂中的CU2+作用生成紫红 色的蛋白质Cii2+复合物。2、Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，蛋白质Ci】2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸 残基还原酚试剂中的磷钮酸和磷餌酸，生成蓝色的化合物。3、在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白 质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白 质的含量。三、材料与方法：以流程图示意1、实验材料（1）样品健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60-80 g/L试剂牛血清白蛋白标准液（20

3、0pg/ml）；碱性硫酸铜溶液；Folim酚试剂2、仪器与器材V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架3、实验步骤（1）图示1 蛋白标准溶液2.碱性硫酸铜溶液混合均匀静置lOmin加酚试齐I图一：Folin-酚试剂法测定蛋白质含量流程图（2）取6支试管做好标记，再按下表加样：（1为空白对照，25作标准，6为待测样 品）试剂（ml）123456牛血清白蛋白标准液- 0.200. 400.600.80样品液（稀释300倍） 0. 50蒸镭水1.00.800. 600.400.200. 501、实验现象记录(1) 在向试管中加入2ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后，溶液澄清，无

4、明显现象(2) 在向试管中加入0.20mLFoliii-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深，水浴后颜色更深，6号试管内溶液颜色介于3、4号试管之间。2、吸光度数据:500mn波长吸收度值记录测定次数各管吸光度值A5002345610.0410.0550.0800.0890.06920.0410.0560.0800.0890.06730.0410.0550.0810.0890.068各管平均值0.0410.0550.0800.0890.068表二：500nni波长吸收度值记录表根据吸光度数据绘制散点图C ( pg/ml)2 1.1aO08060402O图二：5001

5、1111波长吸收度值散点图将测得6号试管吸光度0.068代入标准曲线公式尸0.0006X中，得出样品浓度为113.33（Lig/ml。即：C （未稀释蛋白含量）二C （稀释后蛋白质含量）X2X300=113.33pg/mlx2x300=68000pg/ml = 6800g/L正常人血清蛋白浓度参考范围为：6080g/L以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实验成功。3、讨论（1）实验中操作严格按照实验要求进行，所测样品结果68.00g/L落在正常范围内，可认为本次实验成功。（2）误差分析 在使用加样枪过程中可因试液有少许残留于移液枪头导致操作误差，另外，多次加样

6、也加大了误差。 因反应的显色随时间不断加深，因此实验中若未能及时将溶液转移至比色皿而导致测 定26试管时，各组测定的时间间隔不一致，导致误差。复习思考题:1、试述Folin-酚试剂法的优点？2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？答：1、反应迅速灵敏，现象明显，便于观察与测定吸光度。 不同蛋白质之间所得实验结果差异不大，可选取的试剂种类更为丰富。 操作简单快速。操作更为简便。2、经过课外查阅资料可得下面结论：(1) 干扰物质：硫酸钱、蔗糖等疏基化合物；酚类及柠檬酸；浓度较高的尿素、弧、乙 醴、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等。(2) 原因：因为Folin酚试剂法中应用了双缩眠反应，而

7、上述物质均带有干扰双缩眠试 剂的基团，因此也会干扰Folim酚试剂法。(3) 注意：为了避免干扰，操作过程中应防止该类物质进入试管中；当样品酸度高，应 增加碳酸钠-氢氧化钠浓度以靠近实验所需的碱性环境，使显色反应更为明显；当存在 浓度较高的尿素、肌、乙醍、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等时，应该做校正曲线。仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For personal use only in study and research； not for commercial use.Nur fur den person lichen fur Studien, Forsch ung, zu kom

8、merziellen Zwecke n verwe ndet werde n.Pour I 'etude et la recherche uniquement a des fins personnelles； pas a desfins commerciales.TOJlbKO JIKDAe几 KOTOpbie MCnO/lb3yK)TCfl A/1A oSyMeHMA, MCCneflOBaHMM H Heno/l沐Hbl WCnO/lb3OBaTbCA BKOMMepHeCKMX ue/lflx.以下无正文仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For personal use only in study and research； not for commercial use.Nur fur den person lichen fur Studien, Forsch ung, zu kommerziellen Zwecke n verwendet werde n.Pour I 'etude et la recherche uniquement a des fins personnelles； pas a desfins commerciales.TOJlbKO JIKDAe几 KOTOpbie MCnO/lb3yK)TCfl oSyMeHMfl,