BP基因的表达和病毒复制的关系

1、生物文档，单细胞技术1.1.1 口蹄疫的发现和疫情控制口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）首先是由意大利生理学家Fracastorius在文献中描述的一类牛口足类疾病(Fracastorius, 1546)。1897年，Loeffler和Frosch率先提出了口蹄疫的致病原是一种非细菌、非毒素的可滤过性物质，至此，口蹄疫病毒成为了首先被描述的动物病毒(Loeffler and Frosch, 1897)。其后欧洲各地开始成立专门研究口蹄疫的科研机构，引进几内亚猪作为实验动物(Waldmann. and Page., 1920)，在疫苗的研制方面取得了重要进展(Wald

2、mann and G, 1937)。二战以后，口蹄疫病毒疫苗在欧洲国家广泛应用，使口蹄疫得到了有效的控制。欧盟在1991年开始实施不用口蹄疫病毒疫苗的政策。现今口蹄疫被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物传染病之首，根据各国有无口蹄疫疫情和有无使用口蹄疫病毒疫苗，被严格划分为不同的安全等级，各等级成员国之间的贸易受到严格监控和管制，无口蹄疫国家禁止进口其他国家的有潜在威胁的动物和肉类制品，口蹄疫成为限制动物和肉类进出口的重要因素之一。如图1-1所示，截止2014年七月份，主要的无口蹄疫国家仍然分布在欧美等经济发达地区，也包括澳大利亚、阿根廷等畜牧业大国。近年来，在无口蹄疫地区和国家爆发口蹄疫

3、是在1997年的台湾和2001年的英国，该事件使公众更加深刻的认识到这种传染性偶蹄类家畜疾病的可怕(Grubman and Baxt, 2004)。同时，在2000年，日本和韩国也爆发了口蹄疫，他们分别自1908年和1934年以来都没有出现过口蹄疫疫情(Sakamoto et al., 2002; Shin et al., 2003)。日本还在十年之后的2010年再次爆发口蹄疫(Nishiura and Omori, 2010)。此外，随着美国恐怖袭击的增多，现在担忧恐怖组织会利用口蹄疫病毒来摧毁美国每年价值1000亿美元的畜牧业(Grubman and Baxt, 2004)。这些都使科学界

4、更加重视导致口蹄疫的病原体-口蹄疫病毒的研究和对控制口蹄疫疫情的有效方法的探索。1.1.2 口蹄疫病毒口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)由一条约8500个碱基组成的单股正义RNA基因组和环绕其周围的四个结构蛋白(VP1-VP4)共同形成一个二十面体衣壳结构(Belsham, 1993)。口蹄疫病毒是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的准种。这个属仅有的另一个成员是马鼻炎病毒A(Kraev, 2000)。口蹄疫病毒根据血清学分类分为七个血清型(A, O, C, Asia 1, and South African Territories 1, 2, and 3

5、)，每个血清型又进化出不同的亚型(Knowles and Samuel, 2003)。口蹄疫病毒的衣壳是由60个拷贝的四种结构蛋白（VP1-VP4）排列组成的，其中VP1结构蛋白的G-H loop区域（约在140号位到160号位）暴露在衣壳表面，是抗体识别的主要抗原决定位点(Bittle et al., 1982)。在自然感染情况下，G-H loop里的RGD基序识别上皮细胞上的整合受体并与之结合，完成感染过程(Alexandersen et al., 2003; Monaghan et al., 2005)。在病毒的进化过程中，口蹄疫病毒开始利用除RGD基序之外的其他受体如粘多糖(GAGs)

6、来入侵宿主细胞。口蹄疫病毒的易感性普遍认为是由宿主细胞表面的特异性受体决定的，但仍可能存在一些暂未发现的机制决定口蹄疫病毒对宿主的偏好性(Joern Klein, 2009)。1.1.3 口蹄疫病毒的进化口蹄疫病毒在基因型和表型上都是高度可变的。作为一种典型的RNA病毒，其遵循准种的生物动态变化公式(Domingo et al., 2005)。口蹄疫病毒有着广泛的突变谱，各种随机突变的病毒变种在庞大的种群中形成统计波动，有时小的突变亚群会因为环境的选择逐渐成为优势种群占据主导地位。口蹄疫病毒基因组突变的积累发生于病毒种群的复制遭遇瓶颈时和病毒复制过程中出现碱基突变或核苷酸突变时。经历过几代瓶颈

7、期以后，尽管其基因组已经累计了大量突变，但口蹄疫病毒却通过在这几轮维持相对低水平的适应性复制过程中存活了下来。重要的是补偿性突变会以较低的频率发生。相反，突变基因的复制，突变谱不断增加的复杂性都不会导致病毒的绝种，似乎没有补偿性突变能表现出其适应性增强的能力，即病毒可以跨越错误阀值维持其基因组的形成。在细胞培养过程中，相对低的适应性和低病毒载量都会导致口蹄疫病毒的消失。将对抗传代瓶颈抵御灭绝的分子基础与增强突变基因抵御灭绝做对比，可以为我们理解准种动态提供新的思路。这种比较将提供一种新的抗病毒策略的思路，即人为的将病毒的复制错误转变成错误的灾难。1.2口蹄疫病毒持续感染细胞的研究进展1.2.1

8、 病毒持续感染细胞的建立持续感染（persistent infection，PI）是指病毒在宿主体内长期存活而宿主并不表现出强烈的临床症状，但持续感染动物具有持续向外排出病毒的能力从而成为重要的感染源。持续性感染在自然界普遍存在，有些病毒的长期持续感染会导致宿主严重的疾病甚至死亡(Ahmed et al., 1996)。尤以RNA病毒为甚，如逆转录病毒科的艾滋病病毒感染会导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）(Pantaleo and Fauci, 1996)，黄病毒科的丙型肝炎病毒感染会诱发慢性肝炎最终导致肝癌(Sharara, 1997)。故为了更好的理解病毒与宿主的共生关系，人们开始建立病

9、毒的体外持续感染细胞模型。口蹄疫病毒属于小RNA病毒的一种，在自然条件下可引起偶蹄类动物急性感染，也可以以低毒的形式存在于动物体内产生持续性感染(Prato Murphy et al., 1994)。在体外细胞实验条件下，大部分时候口蹄疫病毒感染会使宿主细胞病变死亡。但通过对培养条件的改变和感染后细胞的筛选，也可以在实验条件下得到持续感染口蹄疫病毒的宿主细胞模型，以期通过对该持续感染细胞（持感细胞）的研究来更好的理解病毒与宿主细胞的共生关系。1985年，西班牙的一个实验室率先建立了C型口蹄疫病毒持续感染BHK-21的细胞(de la Torre et al., 1985)。他们利用噬斑纯化法得

10、到的病毒株感染已经经过一轮病毒筛选的BHK-21细胞，然后分离不同的单克隆并进行扩大培养，最终得到一株能持续传代105次，存活14个月之久的持续感染口蹄疫病毒的BHK-21细胞株，并对该细胞进行了一系列相关研究。间接免疫荧光实验证实该细胞具有口蹄疫病毒的抗原蛋白，同时该细胞还获得了抵抗口蹄疫其他型毒株感染的能力。当该持续感染细胞系传代到一定代次时，持续感染细胞对感染它的病毒产生了更强的体抗力，同时持感病毒在宿主细胞中也进化出了更强的毒力。持续感染细胞在与病毒的共生过程中产生了与正常细胞不同的性状，如细胞形态的改变（变圆）；细胞生长速度的改变（变快）；细胞克隆形成率的改变（变多）(de la T

11、orre et al., 1988)。持续感染脱毒后的细胞仍能完成对病毒的抵御，说明这时细胞已发生了遗传上的改变。这种细胞抵御病毒的机制并不是由于病毒的吸附进入或者脱壳等环节出现了问题，而是某种暂时还未知的细胞内部的某种抵御机制的作用(de la Torre et al., 1989)。2011年，本实验室通过弱碱法处理并借助单细胞分离技术成功构建了O型口蹄疫病毒持续感染BHK-21的细胞株(Huang et al., 2011)。该实验先将低滴度的病毒感染BHK-21细胞，再将感染后的细胞置于含有NH4Cl的弱碱性环境中培养，NH4Cl可以升高内涵物的pH值，降低细胞中口蹄疫病毒的载量。对在

12、弱碱性环境下存活下来的细胞，用单细胞技术分离得到持续感染口蹄疫病毒的单克隆BHK-21细胞17株，并对其中一株进行了后续研究。电镜观察显示病毒粒子以小量的形式分布于内涵体中。Western Blot实验显示持续感染细胞中有病毒蛋白3D（病毒RNA聚合酶）和3CD（3D蛋白的前体蛋白）的表达。本实验室构建的持续感染细胞产生的持感病毒不能在BHK-21细胞中形成噬斑，但毒力比野生型要强。将持感病毒与野生型病毒的全长序列进行比对发现，持感病毒的突变都位于非结构蛋白编码区而不在结构蛋白编码区，即持感病毒具有与野生型同样的细胞识别能力。本实验室持续感染细胞的构建成功也是因为细胞自身的改变促成了病毒持续感

13、染的形成，这与其他实验室的研究结果一致。在其他一些病毒持续感染细胞中，持续感染的建立往往是因为病毒自身遗传性状的改变而导致的，例如缺陷型病毒颗粒的产生或是RNA性状的变异导致的病毒变种(Abrams et al., 1995; Rowe et al., 1997)。在持续感染细胞形成的过程中，宿主细胞和病毒的共同进化应是促使持感形成的主要原因和重要手段。1.2.2 病毒持续感染细胞形成的机制在机体范围内，持续感染的建立依赖于病毒逃逸宿主免疫系统监管的能力。实际上，病毒表面抗原的变异可以使其不被中和抗体所识别，同时还能使被感染的宿主细胞远离杀伤性T细胞的清除(Hohler et al., 199

14、7)。此外，要促成病毒对机体的持续性感染还需要抗病毒细胞因子表达的抑制和免疫耐受。同时，病毒是有器官青睐性的，如淋巴细胞和中枢神经系统的神经元细胞，他们受到血脑屏障的保护在细胞表面不表达主要组织相容复合物家族抗原，这使持续感染的形成少了一份阻力(Joly et al., 1991; Neumann et al., 1995)。对于病毒来说，无论是在体内还是体外，烈性病毒都比非烈性病毒更难形成持续性感染。体外细胞实验条件下，没有宿主细胞因子和免疫系统的干扰，是研究病毒持续感染细胞机制的理想环境。在持续感染的建立过程中，病毒和细胞经历着共进化的过程(Chen and Baric, 1996; De

15、rmody et al., 1993; Ron and Tal, 1985)，此时会出现有利于细胞存活下来的病毒突变体的产生，点突变和缺失是持续感染形成过程中病毒变异的普遍特征。在体外持续感染主要分为两种状态：所有细胞均带有少量病毒但不裂解并持续向环境中排毒的状态和只有部分细胞被裂解性感染了病毒的状态。这并不是用来划分两种不同类型的持续感染细胞，而是持续感染形成的过程中会自然呈现出这两种状态。在持续感染形成的初期，并不是所有的细胞都感染上病毒，病毒仍在感染细胞中大量增殖，随着持续感染的稳定，病毒的复制减弱，细胞的抵抗增强，逐渐形成了几乎所有细胞都带毒却不裂解的相对稳定的共生状态(de la T

16、orre et al., 1989)。1.2.3 病毒在持续感染中的进化在自然界中，RNA病毒的进化过程以每年平均高达10-2-10-3个位点的碱基置换率发生着(Holland et al., 1982)。在少数情况下，通过在特定条件下用噬斑纯化的RNA病毒，并在它们的宿主细胞中的复制频率来证明突变的产生和突变量。在RNA病毒的进化过程中，决定性事件的发生并不来源于明显的外部选择压力（药物，抗体等），这已在水泡性口炎病毒野生型克隆与中性突变株之间的竞争中得到证实(Quer et al., 2001; Quer et al., 1996)。这些研究确定了偶然性中立的概念，也就是说，尽管它是中立的

17、，但它却比其亲本克隆更易受到突变的影响(Wilke et al., 2001)。决定性的另一个例子是在口蹄疫的平行细胞系之间存在同步的记忆基因组的丢失情况(Ruiz-Jarabo et al., 2003)。刚开始准种的组成是确定的，有很多最初的理论研究把其中存在的问题丢给数学术语去解决，决定性只需要确定无限复制的复制子的种群大小(Eigen and Schuster, 1977)。当涉及大量病毒的种群规模时，它可以推断一个真正的病毒准种决定性的行为，并使其有更高的概率被观察到。然而，在口蹄疫病毒的持感过程中，传代之前非常低的种群大小已使决定性行为显现出来。在这种情况下，决定性在持续感染的早期

18、可能被生物环境的选择性需求所利用，上演了一出口蹄疫病毒高动态突变的节目(Hernández et al., 1994)。1.2.4 宿主细胞在病毒持续感染中的进化在一般情况下，病毒持续感染细胞时不会发生细胞的进化，持续感染的发生一般都是伴随着缺陷干扰病毒粒子的产生或形成小的噬斑和病毒突变的产生(Holland et al., 1982; Igarashi et al., 1977)。在口蹄疫病毒持感细胞连续传代的过程中，持续感染细胞会产生比正常概率高许多的形态多样性。在此过程中，病毒产生遗传异质性和细胞异质性的出现可能是病毒长期存在和细胞存活的重要因素(Herrera et al.,

19、 2008)。早前建立的C1-BHK-Rc1持续感染细胞群体是一种带有口蹄疫病毒的进化着的异质群体和多细胞的变种之间的动态混合种群(de la Torre et al., 1985)，其结果是产生了一个生物学上高度灵活的系统，其中许多类型的细胞响应病毒基因组的分布，从而有利于含适当病毒量的细胞的存活。细胞的异质性可能是导致病毒长期持续性感染的重要组成部分(de la Torre et al., 1989)。1.2.5 宿主细胞和病毒在持感中的共进化病毒和宿主细胞的共进化发生在持续感染口蹄疫病毒的BHK-21细胞的传代过程中。在许多研究中，都发现细胞会在病毒持续感染的过程中形成一种极端的表型异质

20、性的现象。有报道称(de la Torre et al., 1989)，实验共选取了248株稳定携带口蹄疫病毒的细胞克隆并在其早代次或晚代次进行了分析。至少六种不同的细胞表型被区分开来，无论细胞形态如何改变，它们都具有抗口蹄疫病毒株C-S8 c1的能力和细胞持续生长的特性。同时检测到的还有不含感染性口蹄疫病毒或病毒RNA的突变株细胞克隆，这表明改变的表型是由可遗传的细胞修饰导致的，在持续感染的过程中被选择性保留了下来。因此，带有口蹄疫病毒的BHK-21持感细胞的进化必须被描述为病毒和多种细胞变种之间的不断作用的异质群体之间的动态过程。我们认为细胞的异质性是通过提供细胞群对口蹄疫病毒的应答来赋予

21、病毒和细胞存活的选择性优势。口蹄疫病毒持感细胞的维持是通过BHK-21细胞和口蹄病毒的共进化来实现的(de la Torre et al., 1988)。1.2.6 口蹄疫病毒持感细胞的应用研究2008年，西班牙Domingo实验室重复了他们二十多年前的口蹄疫病毒持续感染BHK-21的实验(Herrera et al., 2008)。他们试图解开一个疑问，进化能否像磁带般倒回，再次播放它时，结果是会与我们了解的相似或已与我们知道的不同。显然这个问题只能通过实施片段实验（fragmentary experimental）的方法来回答。Domingo在他二十二年前的实验中描述了BHK-21细胞持续

22、感染口蹄疫病毒的建立过程，指出在持续感染的过程中，细胞与感染的病毒之间展现出共同进化的生物学特征(de la Torre et al., 1985)。现在，他们用二十二年前同样的BHK-21细胞和口蹄疫病毒，重新建立了平行的两株持感细胞株。试图找出两个新建立的持感细胞株与早期建立的细胞株相比，它们的进化方向是否相似或有所不同。得到的结论是：（i）尽管口蹄疫病毒的某些遗传位点发生了改变，但病毒和细胞共进化的基本行为特征在三株细胞中是相似的; （）新建立的两株细胞在平行传代过程中表现出惊人的相似性，这揭示在持续感染过程中病毒行为的决定性作用;（iii）选择性RT-PCR扩增检测到由病毒和细胞因素共

23、同介导的病毒正链与负链RNA比例的失衡。该结果证实了细胞与病毒的共进化作用在口蹄疫病毒持续感染细胞时起主要作用并具有可重复的特点，也暗示快速进化的病毒可以组成足够多的测试体系来探测在进化过程中偶然性事件的影响。这种共进化的过程只要在特定的生物学范围之内，它的轨迹都是按特定方向进行的(Herrera et al., 2008)。1.3 EBP基因的相关研究1.3.1 EBP基因的简介及其编码蛋白所行使的功能EBP(Emopamil binding protein）基因位于细胞X染色体短臂上的Xp11.22-p11.23位点（图1-2）(Derry et al., 1999; Tian et al

24、., 1999)，编码一种叫做3-羟基固醇-8，7异构酶（3-beta-hydroxysteroid-delta8,delta7 isomerase） , 是涉及固醇生物合成途径最后步骤中的关键酶之一(Silve et al., 1996)。图1-2. EBP基因在细胞X染色体上的定位EBP通常被翻译成依莫帕米结合蛋白，按其功能翻译为固醇异构酶（sterol isomerase）(Dupuy, 1996)。如图1-3所示，EBP蛋白酶的主要作用是将一种叫做8（9）-胆甾烯醇（cholestenol）的分子转化为7-烯胆烷醇（lathosterol）(Krojer et al., 2014) 该

25、蛋白是定位于内质网上的整合膜蛋白，它是一种与抗局部缺血苯烷基胺钙拮抗剂3H依莫帕米（antiischemic phenylalkylamine Ca2+ antagonist 3Hemopamil）和光亲和性标记物的3H azidopamil（photoaffinity label 3Hazidopamil）都具有高亲合性的结合蛋白。它类似于受体（sigma receptors），可能是高亲和性药物结合蛋白超家族中的一个成员，并广泛存在于不同组织的内质网中(Toyohara et al., 2012)。这种蛋白质的结构与细菌和真菌类药物转运蛋白有相似的特点。它有四个公认的跨膜片段，还包含两个保

26、守的谷氨酸残基，可能与两性分子的跨膜运输有关。该蛋白的另一个显著特征是在其跨膜片段的组成中含有极其丰富的芳香族氨基酸残基（> 23）(Hartill et al., 2014)。有研究报道称这些芳香族氨基酸残基在P-糖蛋白药物转运中发挥作用。该基因的突变会导致型点状软骨发育不全（chondrodysplasia punctata type），又叫CHH综合征（ConradiHunermannHapple syndrome）(Guggenberger et al., 2007; Hartill et al., 2014; Toyohara et al., 2012)。图1-3. EBP的主

27、要催化作用(Guggenberger et al., 2007)从大鼠肝微粒中纯化得到的固醇异构酶的分子量约为80 kDa(Kang et al., 1995; Paik et al., 1986; Yamaga and Gaylor, 1978)。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试中，这种纯化的酶以一条多肽的形式迁移，大小约为 21 kDa，表明大鼠的固醇异构酶是由四个相同的亚基组成的。EBP被发现可以结合一系列结构不同的分子，包括免疫抑制剂（immunosuppressant ）SR31747A (Labit-Le Bouteiller et al., 1998)和化学治疗药物他莫昔芬（ta

28、moxifen）(Cho et al., 1998)。具有抗局部缺血效应的一系列结构不同的复合物，在实验动物脑局部缺血抑制剂3H依莫帕米（3Hemopamil）结合到EBP上时，他们与EBP之间都具有高亲和性。因此EBP可能是抗局部缺血药作用的分子靶标。在对口蹄疫病毒急性感染细胞和持续感染细胞的基因芯片比对研究中发现，EBP基因在口蹄疫病毒急性感染条件下表达量上调，持续感染情况下表达量下调。在荧光定量PCR检测中也得到与芯片一致的结果(Zhang et al., 2013)。那么细胞的EBP基因是否在病毒的感染和复制之间存在某种关系呢？目前尚无其他研究报道。单细胞研究的历史James Eber

29、wine，一位喜欢发明创造的神经学家，早在20世纪90年代初，就用吸管吸取单个细胞的内涵物，运用扩增RNA分子的技术来检测单个细胞中少数基因的表达量。他的数据证实了一个很早就有的假定刺激使神经元的电信号活跃，同时能改变其里面多种RNA的丰度(Mackler et al., 1992)。当时许多研究者都对这一结果持怀疑态度。在那时，谈到在单个细胞中检测其RNA的量，人们首先想到的是运用荧光原位杂交技术来给RNA定位，因为“人们习惯于用显微镜观看RNA，他们想要看见它”宾夕法尼亚大学的Eberwine如是说。20世纪90年代中期微阵列发明以后，基因表达的分析方法发生了跳跃式的发展。特别是高通量RN

30、A测序的崛起，使研究者们可以在一个细胞一次读数中找到所有活化基因的集合，高通量RNA测序是一种可以一次性读出细胞中成千上万的RNA序列的方法。Eberwine和其他研究者运用测序和微流体、流式等技术来描绘单个细胞的表达谱编写RNA分子、测序DNA，甚至描绘代谢和多肽，研究表明单个细胞强烈的表现出他们的独特性。Eberwine最新的研究表明(Eberwine and Bartfai, 2011)，大脑细胞与它的邻居细胞相比只有不到65%的基因是相同。在免疫系统中，细胞因为其表面抗原的不同分为不同的种类，他们表达一系列不同的基因，产生不同的免疫反应(Schubert, 2011)。然而肿瘤细胞的进

31、化却让他们的基因组以不同寻常的方式快速混在了一起。单细胞技术的发展可以让研究者追溯和分类细胞的异质性。这也许是弄清根本问题的唯一出路，即是什么使单独的细胞产生不同的生化功能，细胞在多大程度上受环境的影响，推测学在细胞分子随机噪音中的角色等，这些问题现在已得到越来越多的重视。2009年，Eberwine与哈弗大学的单细胞生物学家Sunney Xie一起在冷泉港实验室组织了一场关于单细胞分析的会议，这次会议召集了47个与会者。2011年7月，有120个人参加了第二次会议。美国NIH也在支持并推动单细胞技术的发展。然而单细胞分析仍然是一个新兴领域，传统的生化手段对单细胞的研究具有其局限性。碾碎和分析

32、大量细胞的内涵物将结果平均化是数以千计实验室每天都在采取的方案。但是，Schroeder说：“每一个细胞都是独立做出决定的”，比如是否产生电脉冲、是迁移还是分化成一个新的细胞类型。着眼于单个细胞可以揭示这些决定是从哪里开始的，这也意味着要给非常小的物体做非常复杂的实验：一个细胞大概宽10m，包含小于1pL的细胞质。而且一些关键的调控分子则更稀少少到只有几个，但这些很难检测到的RNA却在一个细胞中发挥着重要的影响。很多已经建立的技术才刚刚能应用于单个细胞，荧光标签和显微镜的结合可以用来分析已经鉴定过的分子。如果要描绘未经检测过的分子，就需要对一个细胞中表达的RNA进行分类做转录组分析，这需要借助

33、微流体和流式细胞仪等高通量的手段。但将这些技术用于单个细胞并不容易，无论什么研究开始之前第一步都是获取细胞，在90年代初，当Eberwine首先致力于研究神经元的基因表达时，完整获取一个细胞的RNA都是件很困难的事。Eberwine解决了这个问题，用吸管捕获物质来测量其电活性。Eberwine运用这个吸管捕获系统来研究热敏神经元，它是调控体温和发热的细胞。Tamas Bartfai的团队与Eberwine一起检测了该种细胞的转录谱。他们共同鉴定出了作为蛋白药物靶标的G蛋白偶联受体的转录本，但在群体细胞中这些信息是检测不到的(Eberwine and Bartfai, 2011)。随着技术的进步

34、，研究者可以探索一个细胞的异质性。从神经元里切下树突或轴突，Eberwine和他的团队发现树突上的RNA可以记住位置信息并靶向RNA多肽序列(Buckley et al., 2011)，而他们在分析整个神经元时没有发现这种信息。大多数生物学家将需要与生物信息学家紧密合作来评估来自许多单个细胞实验得来的数以千计分子的大量数据，我们知道的最多的单细胞谱学技术就是转录组学。来自剑桥的发育生物学家Azim Surani运用这种方法研究早期的胚胎细胞，由于其数量稀少，很难大量获得。为了追踪胚胎干细胞怎么在培养时转变为多能干细胞，Surani运用了一种将PCR结合RNA测序的单细胞研究方案。为了做到这些，

35、他与其他技术专家合作，在早期鼠胚胎细胞中，检测了12300个基因的表达超过75%的基因是用芯片技术检测的(Tang et al., 2009)。另一个放大一个细胞RNA的技术叫反义RNA（aRNA），这是由Eberwine和他的合作者一起建立的体外转录技术，将一个细胞的RNA拷贝进一个稳定的DNA文库，每个DNA分子包含一段能被RNA聚合酶识别的短序列，最后以DNA文库来为模板合成检测RNA的拷贝数(Van Gelder et al., 1990)。这两种方法各有其优缺点，当某个序列在扩增中占优势时，PCR反应就会产生偏差，所以第一个方案在技术上不如aRNA；但是aRNA的效率不如PCR，而且

36、需要几天时间。很多研究者不仅仅只想了解一个细胞的转录组，还想知道其相应的基因组。尤其是与癌症相关的细胞和它们突变的DNA。来自MD的遗传学家Nicholas Navin和他的合作者Navin测序了100个单细胞的DNA，这些细胞分别来自两个人乳腺肿瘤患者的不同部分，期望能追溯癌症的进化和扩散(Navin et al., 2011)。这个实验花费了几年时间和每个细胞2000美金的代价。最后，Navin测出了一个细胞大约6%的基因组，这足以确定某些大拷贝基因数的变化，但是还是不能看出在癌症的进化中点突变的积累情况。Navin不是唯一致力于解决这个问题的人，另一个研究团队Xie和他的合作者可以测序哺

37、乳细胞85%的基因组序列，这一结果深深震撼了科学界其他研究者。Fred Gage发现长插入原件（long interspersed elements）(LINEs)，一种可以在基因组中移动的DNA序列，在神经元从神经干细胞中分化出来时会形成新的插入元件。每个神经元可能都包含不同数量的(LINEs)插入元件，大多数细胞有80到300个(Coufal et al., 2009)。关于单细胞的问题总是带领研究者走向复杂的实验领域。为了解决这些复杂的问题，Gage与最好的测序专家Roger Lasken合作使该技术变得更加自动化、整体化或试剂盒化。研究者将可以买到将48个步骤整合到一个平台的设备。一些

38、公司正在为实现这个目标而努力奋斗中，期望能提供最小的设备来整合多个步骤进行单个细胞高通量的分析。微流体设备可以分析96个基因在96个单细胞中进行定量。其中，Fluidigm系统采用以前没有的一系列免疫细胞来检验单个细胞对细胞因子的不同反应(Tay et al., 2010)。缩小设备是为了方便使用和实现高通量化，整合步骤可以帮助保全珍贵样品，小体积可以提高生化反应的动态性例如它可以降低PCR反应的偏差。但是高通量技术也有局限，如果它的测量太简单是不行的。 为了抓住一个细胞是怎样运作的，你需要了解的不仅仅是化学变化，还要知道空间和时间的信息。为了整合这些数据，要结合微流体，纳米材料和光学领域。C

39、hius的团队发明了一种单细胞毫微外科技术(Chiu and Lorenz, 2009)，运用“涡旋陷阱”一种光学的方法，可以操作细胞器和液滴。这个团队从单个细胞中分离出了线粒体，准备用他们在“微滴纳米实验室”中做分析，开展涡旋陷阱来融合液滴和改变组分里的内涵物。Chius的实验室还发明了一种微流体设备来定量荧光标签的分子，检测和分析在群体中相当稀少的细胞，如循环血液中的肿瘤细胞。最后，研究者需要将多种技术结合起来，实现他们测量单个活细胞中多种参数的目标。更多的参数我们将能确定，更多的信息我们将能得到：如转录组、多肽组、细胞怎样实现它的外观、对药物的反应等等。1.4.2 单细胞转录谱分析方面的

40、发展1.4.2.1 单细胞转录谱分析技术单细胞转录谱分析是二十多年前由Norman Iscove首创的，他用PCR技术指数扩增单个细胞的cDNA(Brady et al., 1990)，而另一个科学家James Eberwine则是运用基于T7 RNA聚合酶的体外转录技术(IVT)来线性扩增单细胞的cDNA(如图1-4) (Eberwine et al., 1992; Van Gelder et al., 1990)。这些技术都加速了我们对哺乳动物神经系统中的分子发育机制和功能的了解，特别是这些细胞很可能是所有细胞中最异质化的群体。在这种情况下，从长的轴突中获得细胞或亚细胞水平的转录谱，对我们

41、了解它们的研究是很有益的(Dulac and Axel, 1995; Shumyatsky et al., 2002; Tanabe et al., 1998; Yamagata et al., 2002)。自此之后，商业化高通量DNA微芯片的面世（表1-1）使单细胞芯片技术得到长足的发展(Bontoux et al., 2008; Hartmann and Klein, 2006; Jensen and Watt, 2006; Klein et al., 2002; Kurimoto et al., 2006; Sugino et al., 2006; Sul et al., 2009; T

42、ietjen et al., 2005; Tietjen et al., 2003; Xie et al., 2010)。虽然这种方法很是强大，可以获得全基因组的基因表达形式，但cDNA片段以非常短的形式被放大（几百个碱基对），这并不能用于检测可变剪接导致的转录谱的变化情况(Klein, 2005; Klein et al., 2002)。最重要的是，该方法只能用于检测已知基因。图1-4. 单细胞转录谱分析的策略图(Tang et al., 2011)单细胞转录谱的获得为了得到单细胞转录谱，单个完整细胞被分离并转移到含有裂解缓冲液的试管中。然后将全细胞裂解物用寡聚脱氧胸腺嘧啶(oligo dT

43、)引物使带多聚腺苷酸（poly A）尾巴的mRNA逆转录成cDNA的第一条链。残余的mRNA模板被降解，一个poly（A）尾巴被添加到第一条cDNA链的3'末端，这些cDNA被oligo dT引物统一的扩增。该过程的一个关键要求是缓冲液在前面的反应和后面的反应中是兼容的(Kurimoto et al., 2006)。此外，先前步骤使用过的酶需要通过热处理灭活。这种方法避免了额外的分离、沉淀和纯化步骤。扩增好的单细胞cDNA可以先对其量进行测定再用定量PCR（qPCR）的方法定量人们感兴趣的样品，以及后续对其做进一步高质量的分析。分离单个细胞的方法有许多种，用移液管人工分离单个细胞是最直

44、接的选择，尽管这可能是最耗时和最有技术难度的方法(Kurimoto et al., 2006; Tang et al., 2009)。激光辅助显微切割技术（Laser-assisted microdissection）或荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting）也可以用于获得单个细胞，特别是对表面具有标记物或荧光报告基团的细胞亚群的筛选(Galbraith et al., 2004; Schutze and Lahr, 1998; Warren et al., 2006; Warren et al., 2007)。具有细胞壁的高等植物细胞是很难用

45、酶消化分离单个细胞的，但把组织匀浆化后再分离其细胞核却是可行且有效的(Zhang et al., 2008)。在未来，我们应该有可能运用微流体系统在纳升（nanoliter）溶液水平来分离和跟踪数以千计的单个细胞(Bontoux et al., 2008; Spiller et al., 2010)。这将大大提高从各种来源获得的单细胞分析的准确度和效率，包括成体干细胞或癌细胞。对单个细胞进行所有mRNA的分析，首先需要将其从细胞中释放出来，这可以通过向细胞中加入变性剂（detergents）来实现，只需满足与随后的逆转录过程不相干扰这个条件(Kurimoto et al., 2006; Sta

46、hlberg and Bengtsson, 2010)。有几种类型的洗涤剂可供选择，如硫氰酸胍（guanidine thiocyanate）和Nonidet P-40。洗涤剂的类型和使用剂量都需要根据不同的细胞类型来做相应的调整，以获得最好的实验结果，这取决于细胞裂解的特性。当使用到新的细胞类型来进行研究时，需要平行尝试不同的洗涤剂和不同的使用浓度，来获得用于特定细胞类型的最佳裂解方法。在大多数情况下，全细胞裂解物可以直接被用于逆转录而不需要除去该变性剂(Brady et al., 1990; Kurimoto et al., 2006)。另外，也可以先从单细胞裂解物中分离和纯化mRNA，通过

47、使用包被有oligo dT的磁珠或oligo dT肽核酸，它们可以将mRNA从蛋白质、代谢产物和细胞碎片中捕获出来(Hartmann and Klein, 2006; Klein, 2005; Klein et al., 2002)。这个策略已被报道与单细胞的cDNA芯片分析一起使用，这种方法可以与基因组DNA的分离相结合来同时分析细胞的基因型。当分离带poly(A)尾巴的mRNA裂解缓冲液能被洗掉时，可允许使用更强烈的裂解条件来快速有效的释放mRNAs。有几种类型的逆转录酶可用于cDNAs的制备(Taniguchi et al., 2009)。SuperScript III（Invitrog

48、en）是这方面使用率最高的，它可以扩增长达10 kb的全长cDNA。当使用全细胞裂解物时，一般会使用oligo dT引物，因为随机引物会扩增rRNA和tRNA的cDNA，它们的含量比mRNA多两个数量级。为了防止这种情况发生，原则上，要对mRNA进行分离和纯化，然后结合随机引物一起对全长mRNA进行逆转录。dNTP的浓度需要适应逆转录的最优效率，避免干扰后续poly（A）的加尾过程。作为不同基因的mRNA 5'端和它对应的第一条cDNA链的3'端是不同的，使用末端脱氧核糖核苷转移酶对其添加poly(A)尾巴可以使所有表达基因的cDNA得到无差别的扩增。当逆转录和加尾过程完成后，

49、单细胞的cDNA将被扩增。一个具有代表性的单个哺乳动物细胞中含有约10 pg的总RNA和约0.1pg的mRNA ，这需要约千万倍的放大才能在标准芯片分析中找到与其相应的基因。无论是PCR或IVT都可用于扩增(Kawasaki, 2004; Kurimoto et al., 2006; Kurimoto et al., 2007; Livesey, 2003)。PCR扩增的优点是cDNA的量以指数的形式增长，使单细胞中的cDNA可以在几个小时内扩增百万倍；其缺点是引物二聚体的积累和扩增过程中其他非特异性副产物的形成，特别是在PCR反应后期。IVT方法的优点是其严格的特异性，它可以减少非特异性副产

50、品的积累，但其缺点是，只能合成小于1kb的 cDNA。IVT的步骤也更繁琐和耗时，并且每一轮IVT只能将cDNA扩增1000倍左右。在实际试验中，单细胞的cDNA只需进行两轮PCR扩增便可用于芯片分析，而IVT需要三轮扩增或一轮IVT扩增结合一轮PCR扩增才能达到芯片分析的要求。Kurimoto等改进了一种广泛用于单细胞cDNA扩增的方法，它能高度定量，却只会在mRNA的3'末端产生约0.85 kb的片段(Kurimoto et al., 2007)。将其与下一代测序结合来开发单细胞RNA-seq分析技术，提高了该方法的反应效率，并能合成出长达3kb的cDNA片段。使用用胺基修饰过的引

51、物来进行第二轮PCR扩增，可以从测序文库中除去残余的游离引物和引物二聚体来提高反应的通量。此外，一个早前报道过的单个胚胎干细胞的cDNA芯片分析检测到大约6800个不同的基因转录本，而该技术在一个胚胎干细胞中发现了约10800个基因的表达，这意味着此测定方法检测出了比之前多约60%的基因的表达(Tang et al., 2010)。由于下一代测序方法的高灵敏度性，额外的IVT扩增步骤将不再需要。研究发现，该扩增方法可以忠实反应一个小鼠早期卵裂球（blastomeres）的全部转录本。在这个发育阶段，所有的小鼠单细胞都已表达约60%以上的全基因组。还发现在一个细胞中有高达20%的已知可变剪接体表

52、达多种转录突变体，更加体现了单细胞转录组的复杂性。在单细胞的转录本中发现了成千上万个以前未知的外显子，外显子连接位点，这表明对哺乳动物细胞转录组的认识还远远没有完成。应用技术追踪胚胎干细胞从内细胞团囊胚（inner cell mass of blastocysts）中诱导出来的过程，描绘了该方法忠实地对相对小尺寸的单个细胞的工作原理(Tang et al., 2010)。因此，该技术可适用于分析许多在发育胚胎中和成人组织中的不同类型的细胞，尽管该方法至今尚未使用在不同类型的细胞中。扩增后，单细胞的cDNA可以通过芯片或深度测序来做进一步的分析。后者能提供转录组变化至少五倍log动态范围内的更详

53、细和精确的信息(Mortazavi et al., 2008)，但是它价格不菲，且需要更为强大的计算机数据分析能力。在一般情况下，每个细胞20至4000万的测序读取量对大多数用途来说已足够，如检测新的基因、剪接突变、多聚腺苷酸化位点和已知基因的新外显子。迄今为止，只有SOLiD系统用于单细胞RNA的测序（RNA-seq），但是该方法是与测序平台无关的。末端配对读取（Paired-end reads）将能更准确的从单细胞RNA测序结果中确定剪接位点。芯片方法适用于得到已知基因的所有转录组在上下调方面的情况。对于生物信息学分析来说，无论是普通的商业软件还是免费的学术软件都是可用的(Pepke et

54、 al., 2009)。最近为RNA-seq数据分析而开发的生物信息学工具，比如Cufflinks, Scriptur，测序得到的选择性表达分析（ALEXA-SEQ），亚型的混合（MISO）和Trans-ABySS（短序列的组装），都可用于单细胞RNA-seq结果的分析(Griffith et al., 2010; Guttman et al., 2010; Katz et al., 2010; Robertson et al., 2010; Trapnell et al., 2010)。数据标准化在相同批次中的不同样品之间，不同实验室和不同平台样品之间的转录组信息比较方面是很重要的。对于相对

55、定量来说，数据标准化可以是分位点（quantile），每百万配对读取的每kb个外显子读取（RPKM）或每百万配对读取（RPM）。近年开发的“预期唯一的可绘制区域的标准化”方法，可提升单细胞RNA-seq数据的质量(Lee et al., 2011)。Quantile和RPM在单细胞RNA-seq数据标准化方面都已做得很好。但是当RNA-seq方法可以检测cDNAs的全长时，RPKM将是更好地选择。cDNAs的绝对量可以通过spike-in RNA的方法获得，该方法对于那些不存在于细胞转录组中的带poly(A)尾巴的RNA的任何预期量都可进行分析。对于哺乳动物细胞的转录组分析，通常使用编码聚赖氨

56、酸（polylysine）、聚二氨基庚二酸（poly-diaminopimelic acid）、聚苯丙氨酸（polyphenylalanine）或聚苏氨酸（polythreonine）带poly（A）尾巴的RNA作为spike-in RNA。当仅有的几百个拷贝数的spike-in RNA加入单细胞样品时，需要注意确保spike-in RNA不会大量降解。还有需要注意的是，不同类型的细胞体积是不同的，相差可能达到100倍(Baserga, 2007)。绝对定量是衡量一个细胞中每个基因的mRNA的绝对拷贝数，是不考虑细胞体积的。而浓度并不是mRNA的绝对拷贝数，在决定其在细胞中的功能时更为重要。理

57、论上，每个细胞中所有表达基因的RNAs绝对浓度可以从spike-in RNA的使用量结合单个细胞的体积一起得出(Crissman and Steinkamp, 1973)。1.4.2.3 单细胞转录谱分析的应用单细胞转录组分析可以用于全基因组规模的基因调控网络的确定，可以结合目的基因的过表达，敲除或下调来揭示其在靶细胞中是如何调控基因的表达的(Kurimoto and Saitou, 2010; Kurimoto et al., 2008)。这在干细胞和早期胚胎发育细胞的分析中尤为常见，因为该细胞亚群的高度动态性和异质性。细胞异质性分析作为单细胞转录组的一个重要应用出现。即使是高度相似的细胞类

58、型也会以各种各样的原因产生不同的基因表达形式(Huang, 2009)。更重要的是，基因的表达在本质上是随机的，因为不同的微环境或涉及参与转录和翻译的少数分子。可以很确定的说基因表达的异质性是活细胞的固有属性，在生物体中没有严格意义上完全相同的细胞。此外，基因表达的随机特性，可以深刻的影响一个细胞的命运和表型(Spencer et al., 2009)。在一个细胞群体中解析基因表达的异质性将是单细胞分析的一个重要应用。事实上，己有关于Nanog、REX1或stella基因表达的胚胎干细胞亚群的异质性的证据的报道(Chambers et al., 2007; Toyooka et al., 20

59、08)。其实很早就知道了在肿瘤细胞之间存在细胞异质性(Shackleton et al., 2009)，单细胞转录组分析在确定肿瘤的亚细胞群方面和检测假定的癌症干细胞方面是一个可行的方法。因为只有一个细胞需要从组织中分离和裂解，这在理论上，可以非侵入性的方式分析基因表达的网络并监控人类疾病的进展，或监视一个稀有或珍贵的生物样品，并以在整个生理或病理过程中不会对整个样品进行扰乱和消耗的方式进行连续的基因表达动态的追踪。另一个应用是确定亚细胞区室的基因表达谱。众所周知，有来自体细胞的mRNA主动运输到神经元的轴突或树突上进行翻译的事件(Willis and Twiss, 2010)。单细胞转录组分析可以被用来检测明确的定位于轴突或树突的mRNA，它们对决定这些神经元的生理功能方面非常重要。下一代测序技术能提供精确到一个碱基的信息，它也可以分析单个细胞的等位基因表达情况，找到两个等位基因之间单核苷酸多态性的差别(Zhang et al., 20