辣椒炭疽病拮抗放线菌F2的鉴定

1、学士学位论文（设计）（类型：论文）垫江們分析与盼作者：封雪学 号：200906034012指导教师：蒋桂芳专 业：生物科学（师范）提交日期：2013年5月4日答辩日期：2013年5月16日 学位授予单位：重庆文理学院中国重庆2013年5月摘要abstractii1引言12研究区自然状况13材料与方法13. 1采样的区域及方法13.2测定项目及方法错误！未定义书签。3.3评价标准与评价方法错误！未定义书签。错误！未定义书签。3. 3. 1评价标准 3. 3. 2评价方法4结果与分析4.1 土壤重金属测定结果4.2土壤重金属评价55结论6参考文献：7致谢语8敕罐病歸放线菌f2锻定生物科学1班封雪指

2、导教师蒋桂芳摘要：筛选拮抗活性茵株和寻找新的活性代谢产物，可为辣椒炭疽病防治提供新的资 源。此文主要研究永川地区的水果园和蔬菜地采集土壤6份并分离获得放线菌。以辣椒炭疽 杆菌为目标菌，采用抑菌带测定法，筛选获得具有拮抗活性的放线菌菌株f2,通过对菌株 f2形态观察、培养特征观察、生理生化反应和16srdna鉴定，结果表明该菌株为链霉菌属 吸水类群 (streptom)ceshygroscopicus )。关键词：辣椒炭疽病；拮抗放线菌；形态鉴定；生理生化鉴定analysis and evaluation of soil environment quality ofpeony in dianji

3、ang county of chongqingbiological sciences class one zhou xiatutor li huiheabstract: objective to study the heavy metals in the chief soils of peony in dianjiang county of chongqing and provide a basis for the gap base establishment. methods according to the agricultural sector standard (ny 5010一200

4、1 )of china, 6 pollutants of soil were evaluated by means of single pollution index and synthetic pollution indices. results the result of the research indicated that the single pollution index of all sorts of pollution in the soil was less than 1, shows that soil is not overweight pollutant .the 5.

5、3 % synthetic pollution indices of all sorts of pollution in the soil arc greater than 0.7 and smaller than 1 , in the alert level, the rest of the 94.7 % comprehensive pollution index are all smaller than 0.7 ,shows that soil quality is good, reaching the “cleart and "safe" levels. conclu

6、sion the soil environment quality meets the requirement of the organic ding culture environment.key words： dianjiang; peony; soil environment quality;1引言辣椒炭疽病是半知菌亚门炭疽菌属collctotrichuni cord）内几个种所引起的真菌 病害口役 辣椒炭疽病可为害辣椒叶片和果实,在病叶上表现出水浸状褐色圆形斑，病 斑上轮生小黑点；病果上为水浸状褐色圆形斑，病斑逐渐凸起，形成灰褐色、黑色或 橙红色小粒点，对植株伤害很大，所以给生产造成重

7、大损失。日前对防治炭疽病有的主 耍方法有依靠化学药剂防治和品种改良。近年来由于人们对环境问题的h益关注和对绿 色食品的需求，生物防治成为一个很有发展前途的领域，相关试验表明对炭疽病的防治, 生防具有良好的防效。木实验将已分离得到的对辣椒炭疽病具有拮抗作用的放线菌f2,通过对拮抗放线 菌f2的形态鉴定和生理生化鉴定，确定菌株的种属，为进一步研究辣椒生物防治提供 实验条件。2材料与方法2.1材料2.1.1供试靶标菌拮抗放线菌f2：分离口永川区黄瓜山菜园；病原菌:辣椒炭疽病菌 （colletotrichum gloeosporioides）。2丄2培养基放线菌培养用培养基：高氏一号琼脂培养基；鉴定用

8、培养基：（1）高氏i号合成培养基（gau）：可溶性淀粉20 g,硝酸钾1.0 g,氯化钠0.5 g,磷酸氢二钾0.5 g,硫酸镁0.5 g,硫酸亚铁0.01 g,琼脂粉10g, 蒸馆水1000 ml,调节ph至7.27.4。配置时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒 入煮沸的水中，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000 ml。121 °c灭菌20 min。（2）克氏 i 号培养基：葡萄糖 20 g, kno31.0g, nacl 0.2 g, k2hpo41 g, mgco30.3 g, cacoso.5 g, feso40.1 g,琼脂粉 10 g,蒸镭水 loooml,调节

9、 ph7.27.4。（3）蔗糖察氏培养基：蔗糖 30 g, nano33.0 g, k2hpo41.0 g, kc1 0.5g, mgso4 -7h2o 0.5 g, feso4 7h2o 0.01 g,琼脂粉 10 g,蒸憾水 1000 ml,调节 ph7.27.4。（4）燕麦片培养基：燕麦片20 g （水煮30 min,过滤取汁），琼脂粉10g,蒸帼 水 1000 ml,调节 ph7.2-7.4o（5）葡萄糖天门冬素培养基：葡萄糖10 g,天门冬素0.5 g, k2hpo4o.5 g,琼脂粉10g,蒸饴水1000 ml,调节ph7.27.4。（6）马铃薯葡萄糖培养基（pda）：去皮马铃薯2

10、00 g （切片沸水煮30 min,过滤 取汁），葡萄糖20 g,琼脂粉10 g,蒸馆水1000 ml，调节ph7.2-7.4o（7）明胶液化培养基：蛋白腺5.0 g,葡萄糖20 g,牛肉浸膏3.0 g，酵母浸膏1.0 g,明胶 120 g,蒸餾水 1000 ml,调节 ph7.27.4, 115 °c灭菌 10 min。（8）牛奶凝固豚化培养基：牛奶（脱脂鲜牛奶）1000 ml,石蕊液（2.5%） 40 ml,115 °c灭菌10 min，间歇灭菌3次。（9）淀粉水解琼脂:可溶性淀粉 10 g, nacl 0.5 g, kno31.0g, k2hpo40.3 g, mgs

11、o4*7h2o 0.5 g,琼脂粉 10 g,蒸馆水 1000 ml, 121 °c灭菌 20 min。（10）纤维素水解培养基:mgso4 7h2o 0.5 g, nacl 0.5 g, kno31.0g, k2hpo40.5 g,蒸徭水 1000 ml,调节 ph727.4,滤纸条（0.8x5cm）, 115 °c灭菌 10 min。（idh2s产生培养基：蛋白月东10g,胱氨酸0.1 g, na2so40.5 g,麴 水1000ml, 分装试管后，121 °c灭菌20 mine（12）碳源利用培养基：（nh4）2so4 2.64g, kh2po4 0.5g,

12、 k2hpo40.5g, mgs04 7h2o 0.5g, cuso4 *5h2o 0.0064g, feso4 7出0 o.oollg, mnc" <h2o 0.0079g, znso4 -7h2o 0.0015g,琼脂粉 15.0g,蒸镭水 loooml（选用的碳源分别有1%碳源：l阿拉伯糖、d木糖、d葡萄糖、d果糖、l鼠李糖、 蔗糖、d甘露醇、l肌醇）2.2株鉴定2.2.1形态学观察将菌株f2划线接种于高氏一号培养基，28° c插片培养7天和14天，显微镜下 观察菌休的形态特征。2.2.2培养特征的观察将菌株f2分别接种在pda、高氏一号琼脂、察氏琼脂培养基、克

13、氏一号培养基、 葡萄糖天门冬素琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、葡萄糖犬冬素琼脂等培养基上， 28°c培养5天，观察基内菌丝、气生菌丝的生长状况和砲子链的形态及孑包子形状。2.2.3生理生化特性测定测定菌株f2明胶液化、牛奶凝固与陈化、淀粉水解、纤维素的利用、h?s的产 生以及碳源利用等生理生化特性。2.2.4分子生物学鉴定进行了 16srdna的序列分析，其中基因组dna采用碱裂解法14提取质粒dma, pcr 扩增采用 16s rrna 通用引物 (16sl 5-' agagtttgat cctgg ctcag-3' ； 16sr 5' -aaggaggtga

14、tccag ccgca-3'), 每 50 u l 体系含 37.5 u lddh20. 10 倍 pcr-buffer5. 0 u i八 2. 5 mmol/l dntp4. 0 u i八 1 u mol/l 引物各 1.0 u i八 5u/ n l la taq dna 聚合酶 0. 5 ul和 110 ng/u l 模板 dna1. 0 ulopcr反应条件为：94°c 5min,预变性；94°c变性os, 60°c退火45s,72°c延伸2 min,共30个循环，最后72°c延伸10 min。取1%的琼脂糖电泳分析。扩增序列 连

15、入pmd-18t载体，由上海英骏生物技术有限公司进行测序。测得的16s rdna序列与 genbank数据库中序列进行blast分析，并利用bioedit和mega 3. 1软件构建系统进 化树。式屮：p综一为土壤中综合污染指数；pmax-为单项污染指数最大值；一为单项污染 指数平均值。综合污染指数法评价结杲的分级标准见表2o表2 土壤环境质量分级标准等级划分综合污染指数污染指数污染水平1pw0. 7安全清洁207pw1.0警戒级尚清洁3l0pw2.0轻污级超过背景值视轻污染420pw30中污染作物受到中度污染53. 0<p重污染污染已相当严重4结果与分析4.1 土壤重金属测定结果各个样

16、点的土壤屮的铜、镉、珞、铅、碑、汞单项指标元素均有不同程度的检出。根据具测定结果进行了分析。土壤监测分析结果见表3。表3牡丹土壤的重金属监测样点phcu/mg. kg-1cd/mg. kg-1cr/mg. kg-1pb/mg. kg-1as/mg. kg-1hg /mg. kg-118. 1225. 360. 1754. 5429. 5416. 320. 0428.0521. 200.3051.2937.4817.400. 0238. 1522.200. 3051.9637. 6615.880. 0348. 3321. 190. 3243.993& 1313. 500. 0258. 1

17、415. 150. 5344. 9931.4312.420. 0268. 3223. 590. 3252.0535. 5915. 140.017& 3124. 950. 2852. 0934. 8815.600. 0286. 6422.860.0750. 4530. 489. 240. 0695. 7626. 340. 1244. 9929.011& 020.07107. 5128.990. 1046. 5332.9615. 640. 12118.2421.460. 1347.4038. 3514. 280. 03128. 1418. 340. 1348. 5934. 0916

18、.410. 03136. 3326. 010. 1050. 8637.9014. 800. 06147.9423.430. 1656. 8042.9421.820. 0615& 1216. 540. 1953. 2533. 1011. 340. 03168. 1524.680. 2855. 3441.0624. 200. 05178. 1926. 010. 2450. 7934.8620. 700. 0418& 226.990. 2854. 2434. 6019. 440. 02198. 0425. 040. 3052. 0834. 5016. 040.03平均值7. 8323

19、. 180. 2350. 6435. 1916. 220.04标准偏差0. 743. 590. 113.683. 733. 590.03变异系数0. 090. 150.490. 070. 110. 220.61从表3结果中可以发现，各采样点的ph值相差不是很大；各采样点土壤重金属含量差异较明显。各土壤重金属的变异系数在0. 070.61,其含量高低相差悬殊，说明 污染源的存在及其对土壤重金属含量所产生的影响人。cu的含量范|韦|在15. 1528. 99 mg. kg-1,平均值为23. 18 mg. kg-1,变异系数为0. 15,说明各地cu的含量差异不太大;cd的含量范围在0. 070.

20、53 mg. kg-1,平均值为0.23 mg. kg1,变异系数为0. 49,说明 各采样点cd含量的差异较大；cr的含量范围在43. 9956. 80 mg. kg1,平均值为50. 64mg. kg-1,变异系数为0. 07,说明cr含量的差异不大;pb的含量范围在29. 0142. 94 mg. kg-1，平均值为35. 19 mg. kg-1,变异系数为0. 11,说明pb含量的差异不太大；as 的含量范围在9. 2424. 20 mg. kg1,平均值为16. 22 mg. kg1,其变杲系数为0. 22,各 地as的含量差异大；hg的含量范围在0. 010. 12 mg. kg-

21、1,平均值为0. 04 mg. kg1, 其变异系数为0. 61,说明hg含量差异很大"°。4.2 土壤重金属评价对牡丹主产区种植土壤重金属含屋运用上述评价标准得到评价结果（见表4）。表4 土壤重金属评价结果采样地点单项污染指数综合污染指数污染水平cucdcrpbashg10. 250. 280. 220. 080. 650. 040. 50清洁20. 210. 510. 210. 110. 700. 020. 53清洁30. 220. 500. 210. 110. 640. 030.49清洁40.210.530. 180. 110. 540. 020.43清洁50. 15

22、0.880. 180. 090. 500.020.65清沽60. 240. 540.210. 100. 610. 010.47清洁70.250.470. 210. 100. 620. 020.48清洁80.230. 240. 250. 100. 310. 120. 26清洁90. 530. 390. 300. 120.450. 240.44清洁100. 290. 170. 190. 090. 630. 120.48清洁110. 210. 210. 190. 110. 570. 030.43清洁120. 180.220. 190. 100. 660. 030.49清洁130. 520. 340.

23、 340. 150. 370.220.43清洁140.230.270.230. 120. 870. 060. 65清洁150. 170. 320. 210. 090. 450. 030. 35清洁160.250. 460. 220. 120. 970. 050. 73尚清 洁170.260. 390. 200. 100.830. 040. 62清洁180. 270. 470. 220. 100. 780. 020. 59清洁190. 250. 500.210. 100.640. 030. 50清洁平均值0. 260. 400. 220. 110. 620. 060. 50清洁从土壤觅金属评价结

24、杲中可以看出，采样点全汞、全偌、全铅、全铜单项污染指数 均较低；汞的单项污染指数范i韦i为0.010.24,镉的单项污染指数为0. 170. 88,珞 的单项污染指数范围为0. 180. 34,铅的单项污染指数范围为0. 080.15,铜的单项 污染指数范围为0. 150.53。但础的单项污染指数范围相对较高，为0.310.97,最 大值为0.97,接近1 了，应引起注意。齐项重金属的单项污染指数范围单项污染指数 均小于1,表明土壤无超标污染物。综合污染指数评价结果显示，94.7%±壤样地的综 合污染指数均小于0.7,污染等级为安全，处于“清洁”的水平；5.3%的土壤样地的 综合污染

25、指数大于0.7,处于警戒级，污染水平为“尚清洁”，虽然还未受到污染，但 已经足够引起我们的重视，在今后的施吧过程中尤其要谨慎。5结论牡丹在地生长时间较长，一般需要45年左右的时间才能采挖，因此土壤质量对 于优质药材的形成尤为重要。h前，牡丹主产区的土壤环境质量状况良好。土壤质量的 平均综合污染指数为0. 58,属于清洁范围，表明牡丹种植基地的土壤质量符合屮药 材生产质量管理规范（gap）的相关要求，适合绿色药材的栽培。在今斤的生产发展过程中，要注意牡丹药材的施肥，农药喷洒应坚持科学合理的原 则，既要保证药材质量，乂耍注意使具免受病虫害威胁。药材的肥料应尽量选择农家肥, 减少使用化吧，避免重金属

26、的污染帅保证产区优质生态环境的持续。并且应定点、 定期对牡丹主产区基地的环境状况进行监测，防治重金属的富集，确保牡丹产地土壤环 境质量符合绿色药材生产需要，促进垫江牡丹药材生产健康、持续发展。参考文献：1 陆家云.植物病原真菌学m.北京：中国农业出版社，2001. 454 456.2 高必达.园艺植物病理学m.北京：中国农业出版社，2005.179 -180.3 汪爱娥，丁克坚，马珂辣椒炭疽病的研究进展j.安徽农业科学，2005, 33 (3): 508 509.4 马荣群，黄粤，宋正旭，等.辣椒炭疽病3病原核糖体基因its区的序列测定及分析j. 西南农业学报，2007, 20 (6): 1234 - 1237.5 po po than, haryudian prihastuti, sitthisack phoulivong, et a 1 .chili anthracnose disease caused by col 1etotri