植物组织培养第四章胚胎培养和离体授粉

1、 第四章第四章 胚胎培养及离体授粉胚胎培养及离体授粉 目的与要求目的与要求 了解植物胚培养类型、过程、培养条件，以及胚了解植物胚培养类型、过程、培养条件，以及胚培养的应用。了解植物胚乳培养过程和培养条件，了培养的应用。了解植物胚乳培养过程和培养条件，了解胚乳培养在实践中的应用。认识植物胚珠和子房培解胚乳培养在实践中的应用。认识植物胚珠和子房培养方法及其在生产上应用。养方法及其在生产上应用。 具备胚胎培养基本认知，有进行各类胚胎培养的具备胚胎培养基本认知，有进行各类胚胎培养的基本能力。基本能力。一、胚胎培养概念一、胚胎培养概念 胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离，培养胚胎培养是将植物的胚胎与母体分

2、离，培养在已知化学成分的培养基上。在已知化学成分的培养基上。二、胚胎培养应用：二、胚胎培养应用： 1 1、解决育种中实践中遇到的问题；、解决育种中实践中遇到的问题； 2 2、研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外、研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外因素。因素。三、胚胎培养类型三、胚胎培养类型 幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养养、子房培养第一节第一节 胚培养胚培养一、培养类型一、培养类型 所谓胚培养就是采用人工方法把胚从种子、所谓胚培养就是采用人工方法把胚从种子、子房、胚珠中分离出来，放在无菌条件下让其进子房、胚珠中分离出来，放在无菌条件下

3、让其进一步生长发育、以至形成幼苗的过程。一步生长发育、以至形成幼苗的过程。1 1、离体胚培养时期、离体胚培养时期 自养期：自养期：能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。 异养期：异养期：幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 2 2、离体胚培养类型、离体胚培养类型 成熟胚培养（子叶形成以后）成熟胚培养（子叶形成以后） 幼胚培养（子叶形成之前）幼胚培养（子叶形成之前） 二、培养过程二、培养过程1 1、幼胚培养过程、幼胚培养过程hanninghanning早在早在19041904年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发年就培养了萝卜和辣根菜的胚，发

4、现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，现离体胚可以充分发育，并且提前萌发形成小苗，这是世界上胚培养最早获得成功的一例。这是世界上胚培养最早获得成功的一例。幼胚培养的关键技术：取材时期幼胚培养的关键技术：取材时期 幼胚剥离幼胚剥离 培养条件的控制培养条件的控制 （是否需要特殊处理）（是否需要特殊处理） 成熟或未成熟子房成熟或未成熟子房70%70%酒精浸数酒精浸数s s0.1%0.1%升汞或饱和漂白粉浸升汞或饱和漂白粉浸10-30min10-30min无菌水冲洗无菌水冲洗剖出胚珠剖出胚珠取出完整胚取出完整胚接种在培养基上。接种在培养基上。 一般采用固体培养法。（同时配制两种培养基）一般采用固

5、体培养法。（同时配制两种培养基） 培养条件：培养条件： 20-3020-30，2000lx2000lx。10-14h10-14h幼胚离体培养的生长发育方式；幼胚离体培养的生长发育方式； (1)(1)胚性发育胚性发育 胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不能萌发成苗。能萌发成苗。 (2)(2)早熟萌发早熟萌发 幼胚不再发育，迅速萌发成幼苗。多数情况幼胚不再发育，迅速萌发成幼苗。多数情况一个幼胚萌发成一个植株，有时因细胞分裂形成许一个幼胚萌发成一个植株，有时因细胞分裂形成许多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。

6、 (3)(3)愈伤组织愈伤组织 多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体或形成芽苗。体或形成芽苗。2 2、成熟胚培养过程、成熟胚培养过程 种子种子95%95%酒精消毒酒精消毒选取完好种选取完好种子子70%70%酒精浸数酒精浸数s s0.1%0.1%升汞或升汞或10%10%次氯酸钠浸泡次氯酸钠浸泡无菌水冲洗无菌水冲洗种子培种子培养几天养几天剥离种胚剥离种胚接种在培养基上。接种在培养基上。 培养条件：培养条件： 黑暗培养、黑暗培养、2525三、影响因素三、影响因素（一）培养基（一）培养基1 1、无机盐、无机盐 成熟胚是含有根原基和茎原基以及一个或两个次成熟胚是

7、含有根原基和茎原基以及一个或两个次生附属子叶。培养时进一步发育产生根和茎，此时生附属子叶。培养时进一步发育产生根和茎，此时在营养上相对独立，在营养上相对独立，只需要提供简单的营养条件，只需要提供简单的营养条件，在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长。 幼胚则是异样的，要求更复杂的培养基。幼胚则是异样的，要求更复杂的培养基。除了一除了一般的无机盐成分外，还要加入微量元素和生长辅助般的无机盐成分外，还要加入微量元素和生长辅助物质，不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同，物质，不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同，胚龄越小培养及成份越复杂。胚龄越

8、小培养及成份越复杂。 2 2、糖类、糖类 幼胚需要蔗糖浓度较高幼胚需要蔗糖浓度较高作用：调节培养基渗透压，作为碳源和能源，作用：调节培养基渗透压，作为碳源和能源，防止幼胚早熟萌发。防止幼胚早熟萌发。 成熟胚成熟胚2%2%，幼胚，幼胚8-12%8-12%。培培养过程中，转移到蔗糖水平低的培养基上。养过程中，转移到蔗糖水平低的培养基上。3 3、氨基酸和维生素、氨基酸和维生素 加入氨基酸，能刺激胚加入氨基酸，能刺激胚的生长。加单一氨基酸时，的生长。加单一氨基酸时，以谷氨酰胺最好。以谷氨酰胺最好。维生素对幼胚是必须的，对已萌发的胚，可能维生素对幼胚是必须的，对已萌发的胚，可能有抑制作用。有抑制作用。4

9、 4、植物生长调节物质、植物生长调节物质成熟胚一般不需要外源激素就可萌发成熟胚一般不需要外源激素就可萌发，但加入，但加入激素可显著增加培养物的生长，尤其对打破休眠。激素可显著增加培养物的生长，尤其对打破休眠。幼胚培养的关键是使加入的生长调节剂和植物幼胚培养的关键是使加入的生长调节剂和植物内源激素间保持某中平衡，以维持其胚性生长。内源激素间保持某中平衡，以维持其胚性生长。5 5、天然有机物、天然有机物加入一些天然的胚乳或种子提取物，对离体胚加入一些天然的胚乳或种子提取物，对离体胚生长有促进作用。生长有促进作用。 （二）培养条件（二）培养条件1 1、ph 5.2-6.0ph 5.2-6.0，水稻，

10、水稻5.0,5.0,柑橘柑橘5.85.82 2、温度、温度 25 -30 25 -30 左右左右3 3、光照、光照 黑暗或弱光黑暗或弱光4 4、培养基形态、培养基形态 液体适合幼胚培养，固体适液体适合幼胚培养，固体适合成熟胚培养合成熟胚培养 （三）胚柄（三）胚柄胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，当胚达到球形期，胚柄发育到最大。当胚达到球形期，胚柄发育到最大。胚柄可参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很胚柄可参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很难与胚一起剥离出来，所以难与胚一起剥离出来，所以培养的胚都不具备完整培养的胚都不具备完整的胚柄。的胚柄。在

11、幼胚培养中，胚柄的存在对幼胚的存活是关键。在幼胚培养中，胚柄的存在对幼胚的存活是关键。因为胚柄的存在会显著刺激胚的进一步发育，在胚因为胚柄的存在会显著刺激胚的进一步发育，在胚发育的心形期达到高潮。发育的心形期达到高潮。没有胚柄存在时，一定浓度范围的没有胚柄存在时，一定浓度范围的ktkt可促进幼胚可促进幼胚生长，但赤霉素作用更好。生长，但赤霉素作用更好。 四、胚培养的应用四、胚培养的应用1 1、远缘杂交中应用、远缘杂交中应用2 2、克服珠心胚的干扰，提高育种效率、克服珠心胚的干扰，提高育种效率3 3、缩短育种周期、缩短育种周期4 4、测定休眠种子的萌发率、测定休眠种子的萌发率5 5、理论研究中应

12、用、理论研究中应用 胚胚珠珠及及胚胚囊囊的的发发育育 第二节第二节 胚乳培养胚乳培养 胚乳培养胚乳培养将胚乳从母体上分离出来，将胚乳从母体上分离出来，在无菌条件下人工培养，使其生长发育成在无菌条件下人工培养，使其生长发育成为幼苗的过程。为幼苗的过程。 胚乳培养的最早研究始于胚乳培养的最早研究始于19331933年，年，lampelampe和和millsmills首例进行了玉米胚乳培养。首例进行了玉米胚乳培养。到目前为止，已有到目前为止，已有4040多种植物的胚乳进行多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马

13、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。到愈伤组织。 一、培养过程一、培养过程 1 1、胚乳外植体的制备、胚乳外植体的制备 胚乳较大块组织的种子胚乳较大块组织的种子，可直接将，可直接将种子表面灭菌，无菌条件下除去种子的外皮种子表面灭菌，无菌条件下除去种子的外皮即可培养。即可培养。 桑寄生类植物桑寄生类植物，胚乳被流质层包裹，胚乳被流质层包裹，不好取出胚乳，可先将种子表面灭菌，无菌不好取出胚乳，可先将种子表面灭菌，无菌条件下剥开种皮，去掉粘性流质

14、层，取出胚条件下剥开种皮，去掉粘性流质层，取出胚乳。乳。 带果实的的种子（斛寄生类），带果实的的种子（斛寄生类），取取授粉几天后的幼果，表面灭菌后，无菌授粉几天后的幼果，表面灭菌后，无菌条件下切开幼果，取出种子，小心分离条件下切开幼果，取出种子，小心分离出胚乳，接种在培养基上。出胚乳，接种在培养基上。 培养室温度培养室温度25-2725-27，黑暗或弱光下，黑暗或弱光下 桑寄生科桑寄生科 蔷薇亚纲的一科。半寄生性灌木，稀草本，蔷薇亚纲的一科。半寄生性灌木，稀草本，寄生于木本植物的枝上，少数为寄生于根部寄生于木本植物的枝上，少数为寄生于根部的陆生小乔木或灌木。花以造孢细胞发育成的陆生小乔木或灌木

15、。花以造孢细胞发育成的胚囊所代替。主要产于世界热带地区，温的胚囊所代替。主要产于世界热带地区，温带分布较少。中国，大多数分布于华南和西带分布较少。中国，大多数分布于华南和西南各省区；有些种类可供药用，如桑寄生、南各省区；有些种类可供药用，如桑寄生、广寄生、槲寄生等。根据花的形态、花粉粒广寄生、槲寄生等。根据花的形态、花粉粒和果的构造不同，分为桑寄生亚科和槲寄生和果的构造不同，分为桑寄生亚科和槲寄生亚科。亚科。 2 2离体胚乳的发育及其植株的形成离体胚乳的发育及其植株的形成 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 胚乳接种后的胚乳接种后的6-106-10天后，不断增生成乳白天后，不断增生成乳白色团状，成为

16、愈伤组织。少数胚乳外植体可转为色团状，成为愈伤组织。少数胚乳外植体可转为绿色叶状丛。绿色叶状丛。 愈伤组织的再分化愈伤组织的再分化 生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养，生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养，此时需光。此时需光。有器官发生和胚胎发生途径有器官发生和胚胎发生途径。 胚乳苗的生根培养胚乳苗的生根培养 转入生根培养基转入生根培养基10-1510-15天后即可长根天后即可长根 植物胚乳可分为两大类：植物胚乳可分为两大类： 被子植物胚乳被子植物胚乳被子植物中它是双被子植物中它是双受精的产物，胚乳属于受精的产物，胚乳属于三倍体三倍体。 裸子植物胚乳裸子植物胚乳裸子植物很特殊，裸子植物很特殊

17、，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为是的胚乳为是单倍体单倍体。 3 3、适合培养的胚乳的发育时期、适合培养的胚乳的发育时期 几种植物胚乳培养的最佳时间几种植物胚乳培养的最佳时间( (授粉后授粉后天数天数) ) 大大 麦麦 10101212天天 黄黄 瓜瓜 7 71616天天 小黑麦小黑麦 7 71414天天4 4、胚乳植株染色体数目的检查、胚乳植株染色体数目的检查 取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤组织，组织，0.2-0.5%0.2-0.5%秋水仙素（或对二氯苯饱和秋水仙素（或对二氯苯饱和溶液）溶液）2525下处理下处

18、理4-8h4-8h，流水冲洗，卡洛氏，流水冲洗，卡洛氏液或液或faafaa固定，固定，1mol1mol盐酸盐酸6060水溶下水解水溶下水解10min10min，染色、压片、观察。，染色、压片、观察。 二、影响因素二、影响因素（一）培养基（一）培养基1 1、white white 和和 msms2 2、辅助生长物质、辅助生长物质 2,4_d2,4_d，玉米素等，玉米素等3 3、天然提取物、天然提取物 20%20%番茄汁、葡萄汁、玉米番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳培汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳培养养4 4、蔗糖、蔗糖 3-5%3-5%。小麦。小麦8%8%，

19、枸杞，枸杞5%5%二、影响因素二、影响因素（二）培养条件（二）培养条件1 1、ph 4.5-6.3ph 4.5-6.32 2、光照、光照 10-12h10-12h黑暗和光照交替黑暗和光照交替3 3、温度、温度 24-2624-26二、影响因素二、影响因素（三）胚的影响（三）胚的影响 带胚的胚乳产生愈伤组织带胚的胚乳产生愈伤组织比不带胚的高。比不带胚的高。当愈伤组织形成后，除去胚并不当愈伤组织形成后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。胚对胚乳培养的影响与胚影响胚乳组织的增殖。胚对胚乳培养的影响与胚乳的生理状态或年龄有关。处在旺盛生长期的未乳的生理状态或年龄有关。处在旺盛生长期的未成熟胚，在诱导培养基

20、上无胚存在时，可形成愈成熟胚，在诱导培养基上无胚存在时，可形成愈伤组织。对成熟胚乳，特别是干种子的胚乳进行伤组织。对成熟胚乳，特别是干种子的胚乳进行培养时，由于其生理活动十分微弱，在诱导其脱培养时，由于其生理活动十分微弱，在诱导其脱分化前，必须借助于原位胚的萌发使其活化。胚分化前，必须借助于原位胚的萌发使其活化。胚对胚乳的增殖作用，对胚乳的增殖作用，有人认为是某种有人认为是某种“胚性因子胚性因子”在起作用，这种胚性因子可能是赤霉素在起作用，这种胚性因子可能是赤霉素。二、影响因素二、影响因素（四）胚乳发生类型和发育程度（四）胚乳发生类型和发育程度1 1、发生类型：、发生类型： 核型：核型：精核与

21、极核受精后，只以核的分裂方式增殖。占精核与极核受精后，只以核的分裂方式增殖。占61%61% 细胞型：细胞型：受精后，以细胞分裂方式增殖。受精后，以细胞分裂方式增殖。 混生目型：混生目型：两种方式混生增殖。两种方式混生增殖。2 2、发育时期：、发育时期： 早期：早期：愈伤组织诱导率低愈伤组织诱导率低 旺盛生长期：旺盛生长期：最容易诱导产生愈伤组织最容易诱导产生愈伤组织 成熟期：成熟期：诱导率很低。水稻和桑寄生科的一些木本植物例外诱导率很低。水稻和桑寄生科的一些木本植物例外 胚乳培养中，旺盛生长期是取材的最适时期。胚乳培养中，旺盛生长期是取材的最适时期。三、再生植株的染色体倍数三、再生植株的染色体

22、倍数1 1、稳定型、稳定型 继代培养后染色体无变化，植株三倍体继代培养后染色体无变化，植株三倍体2 2、畸变型、畸变型 细胞染色体异常，植株为多倍体，且不一细胞染色体异常，植株为多倍体，且不一致，形成多种倍性细胞组成的嵌合体。致，形成多种倍性细胞组成的嵌合体。四、胚乳培养的应用四、胚乳培养的应用培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。三倍体三倍体六倍体六倍体生产生产倍性多样性倍性多样性筛选非整倍体植株筛选非整倍体植株杂种胚乳杂种胚乳附加系和换代系附加系和换代系遗传育种遗传育种 第三节第三节 胚珠和子房培养胚珠和子房培养一、胚珠培养一、胚珠培养 将

23、胚珠从母株中分离出来，放在无菌的人工环将胚珠从母株中分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的过程。过程。 根据胚珠是否受精分为两类：根据胚珠是否受精分为两类： 受精胚珠的培养受精胚珠的培养 未受精胚珠的培养未受精胚珠的培养（一）胚珠培养的过程（一）胚珠培养的过程1 1、胚珠的获取、胚珠的获取 培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房，培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房，如培养未受精胚珠，则在授粉前摘取子房。如培养未受精胚珠，则在授粉前摘取子房。 表面灭菌表面灭菌 剖开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接剖开子房壁，取出胚珠或带

24、胚珠的胎座接种。种。2 2、培养条件、培养条件 固体培养基，固体培养基，whitewhite，nitschnitsch（普遍使用），（普遍使用），msms培养基。附加天然有机物和氨基酸。培养基。附加天然有机物和氨基酸。 蔗糖浓度：幼嫩胚珠蔗糖浓度：幼嫩胚珠4-10%4-10%，胚珠内含有合子和，胚珠内含有合子和少数胚乳核少数胚乳核5-6%5-6%，刚受精的胚珠，刚受精的胚珠8%8% 室温室温2626，50-60%50-60%相对湿度，光照相对湿度，光照18h18h，3 3、受精胚珠的发育、受精胚珠的发育 胚珠胚珠种子种子 胚珠胚珠愈伤组织愈伤组织二、子房培养二、子房培养 将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。的过程。 根据培养的子房是否授粉分为：根据培养的子房是否授粉分为： 授粉子房培养授粉子房培养 未授粉子房培养未授粉子房培养（一）子房培养的过程（一）子房培养的过程1 1、子房的获取、子房的获取 未授粉子房在开花前未授粉子房在开花前1-51-5天摘取子房，授粉子天摘取子房，授粉子房在授粉后摘取子房。房在授粉后摘取子房。 灭菌