干细胞治疗糖尿病探究近况

1、干细胞治疗糖尿病探究近况关键词糖尿病干细胞胰岛【摘要】本文对本世纪以来干细胞治疗糖尿病的若干 研究，包括胰岛的体内发育、分化及其标志物，以及应用胰 导管干细胞和胚胎干细胞进行定向诱导分化为胰岛对糖尿 病进行细胞治疗的实验进行了综述。随着干细胞技术的不断 完善，人类最终能治愈糖尿病。 全球糖尿病 (diabetesmellitus, dm)患者约 1. 25 亿(我国也已达 4000 万)，预计2025年将达3亿1,已成为严重危害人类健康 的重大疾病之一，特别是久病引发的多系统损害，及最终的 肾功能衰竭。dm发病机制复杂，涉及遗传、环境、免疫调控和化学因子。自1922年发现了胰岛素至今，dm的治

2、疗 以药物和注射胰岛素为主，目前，学者们开始关注经胰岛移 植恢复患者体内代谢紊乱的方法，但因组织来源匮缺，制约 了胰岛移植研究的开展，因此寻找合适的胰岛移植物的研究 便成为了当务之急。随着分子、细胞和发育生物学技术的进 展，增加了干细胞定向诱导分化成胰岛的可能性但由于这一 技术还处于实验室的实验阶段，而且方法也并不统一，因此 有必要将近期研究进行汇总，希望能对在这方面进行研究的同僚们有所帮助。1胰岛体内的形成、发育、分化与鉴定 1. 1胚胎胰岛分化胚胎胰岛的分化分4个阶段：(1) 胚胎910周为零散的多激素细胞阶段；(2)胚胎1115 周为未成熟的多激素阶段；(3)胚胎1619周为单激素核 心

3、胰岛阶段；(4)胚胎30周后为多形胰岛阶段(bocian, histochemcellbiol, 1999)o在胰岛形成过程中，内胚层细 胞形成许多小导管网，其末端膨大部分的细胞团发育为外分 泌腺泡，与此同时，一些细胞群或细胞索不出现管腔，卷 成团并与其他细胞索分离开，分散在腺泡之间，内含丰富的毛细血管网，最后发育成具有内分泌功能的胰岛。1.2胰岛细胞分化的调节ferber 2认为胚胎发育早期的信号 源于脊索，后期的信号源于间质，经诱导的胰管上皮细胞增 殖分化形成胰岛细胞，但至今为止其诱导因素并无统一认识opdx1： 一种同源框转录因子(homeoboxtran script ionfacto

4、r),即胰十二指肠 同源异 型盒基因(pa-ncreaticandduodenalhomeobox 1),编码胰腺 十二指肠同源框蛋白1,又称ipf-1、idx-1. iuf-lo lu (lu, endocrinology, 1996)认为pdx1是胰腺发育及胰岛素基因 转录表达的关键性转录因子，即决定于胰腺前体细胞向b、a、 d细胞的分化。mckirmon 3认为pdx1对于肠内胚层背胰 芽和腹胰芽的生长、分化起重要作用。dutta 4认为早期 胰腺表达的pdx-1对胰腺上皮的形成和分化是必需的。gu5 认为所有胰腺细胞均来源于pdx1表达的前体细胞，是最先 发现的胰腺发育决定基因，随着胰

5、腺发育pdx1的表达逐渐 减弱，如缺失将导致胰腺无法形成。docherty 6的研究 证实小鼠pdx1基因的纯合子缺失、突变会导致胰腺无法形 成。 ngn3：ngn3即神经元素3 (neurogenin3),是胰腺 发育过程中短暂表达的蛋白，可能是胰腺内分泌细胞系的定 向因子，且在成熟胰岛中不存在。用pdx1启动子促进转基 因小鼠中早期胰腺前体细胞中ngn3表达，会导致内分泌细 胞数增加，外分泌细胞数减少。ngn3缺失的纯合子小鼠中胰 岛细胞和nestin+胰岛前体细胞在发育各阶段都缺失6。lee 7认为ngn3基因与胰岛分化有密切关系，因为ngn3 基因缺陷小鼠不能表达胰岛其他特异性转录因子

6、，包括 isletl. pax4、pax6,而缺乏 pax6、neu _ rodl. nkn6. 1 或 nkx2. 2的动物胰腺中表达ngn3,表明ngn3位于这些因子的 上游，且对启动内分泌细胞分化必不可少，而分化后期关闭。 gasa 8通过表达的腺病毒感染胰腺导管细胞，建立了体 外调控分化模型，发现ngn3和neurodl活化胰岛分化的基 因并不重叠，表明这两个bhlh蛋白在胰岛发育活动中具有 不同的功能。mellitzer 9通过将cdna插入到前体细胞 的3端非翻译区，通过eyfp定位ngn-3表达，发现内分泌 前体细胞在缺乏间充质信号刺激情况下，可在体外扩增，向 内分泌细胞分化为其

7、默认的途径。leon 10用抗新霉素基因筛选用含nkx6. 1前体基因质粒转染鼠胚胎干细胞。培养 后用筛选nkx6. 1阳性细胞，发现这些细胞分泌胰岛素，注 入糖尿病鼠体内可使其血糖恢复正常。foxa2：内分泌的关键调控基因是forkhead基因fox a 2o guo 11诱导内 胚层分化的研究发现，fox a 2可被foxd3激活，而被0ct4 抑制。内胚层分化可通过抑制0ct4表达实现。fox a 2基因 关键参与肺、肝、胰发育。缺乏foxa2基因，鼠不能产生 前、中肠内胚层(ang, cell , 1994)o hnf：hnf4参与肝、 肠、胰分化，缺失可致年轻人成熟期发病的糖尿病 (

8、maturityonsetdiabetesmelli tusinyoung , mody1 )。hnf1 a (tcf1) hnf4或fox a 2及pdx-1双杂合缺失,导致 b细胞功能缺陷，提示这些基因构成b细胞发育的基因网 络(yamagata, nature, 1996)o hnf6-/-鼠,腹胰发育缺陷 及胆管发育异常，该基因需ngn3激活(yamagata, nature, 1996)o hnf6 还激活 fox a 2a 基因。 pax： pax-4 和 pax-6 同属pax基因家族，其在胰腺内分泌细胞分化中起关键作用o sosa (sosa, nature, 1997)将 l

9、acz 插入到 pax 基因中作 标记，发现pax-4失活的新生鼠经免疫组织化学法显示缺少 b细胞和5细胞，a细胞排列不规整。pax-6缺失,a细 胞缺如，而胰岛素和生长抑素分泌细胞却可出现(st-onge, nature, 997)o由此推断出pax-6是a细胞发育所必需， 而非b、§细胞发育所必需。 chiang 12为分析单 个胰腺细胞的转录模式，改进了基于pcr的cdna扩增方法, 即将单个胰腺细胞中的cdna与含有95个常见胰腺细胞表达 基因的dna芯片进行杂交，芯片上的基因包括转录因子，信 号传导分子以及对照基因。研究者观察了胚胎10. 5d小鼠的 胰腺分离出的单个细胞中

10、的基因表达模式。在这个时期上皮 细胞的形态均一，而基因表达模式分析可分为6个不同的亚 型。i型只表达pdxl, nkx2. 2和nkx6. 1, ii型还表达p48, iii型还表达ngn3o因为pdxl是最早表达的胰腺脏细胞标 记蛋白，因此研究者认为i型细胞是最好的胰腺干细胞候选 者。ii型细胞表达的p48是外分泌胰腺细胞的标记，而 nkx2. 2和nkx6. 1是内分泌细胞分化所必须的。研究者根据 这些研究结果推测出一个胰腺细胞分化的模型，每一个阶段 都对应相应的基因表达模式。此外，成体的胰岛内分泌细胞 4050d更新一次，其过程包括细胞凋亡和胰导管干细胞增 殖分化成新的胰岛细胞。给予葡萄

11、糖或高血糖素样肽(glucagon-likepeptied, glp1)等促胰岛因子 48h 后,胰 岛细胞数量可增加一倍，说明机体胰岛在一定的条件与需求 下进行着不断更新与增殖的(rosenberg, celltransplant, 1995)o 1. 3胰岛前体细胞的标记jindal (jindal, transplan - tationproceeding, 1997)认为胰脏的外分泌 细胞和内分泌细胞都来源于具有导管细胞特征的未分化上 皮细胞，提示胰导管细胞可能是胰岛的前体细胞。berger13也发现胰腺中存在干细胞，认为胰腺干细胞是胚胎发 生中没有进行终末分化的胰腺细胞，具有自我更新

12、和分裂能 力。应用he染色显示该细胞是一种嗜碱性的单核细胞，直 径约8um,呈圆形，细胞核为圆形或肾形，较大，多含2个 核仁，染色质细腻而分散，胞质中不含颗粒，在形态上与小 淋巴细胞极为相似。近年来的研究揭示了胰岛前体细胞的特异性标记物，这对胰岛前体细胞的提取将有很大的帮 助，目前较为公认的特异性标记物有以下几种，还有很多标 记物有待于发现。酪氨酸轻化酶(tyroxinehydroxy - lase, th)：在大鼠胰腺发生中表现出发育依赖性变化。第16天胚 胎的导管细胞可见th的表达，但成熟的内分泌细胞中却难 以检测到th,胎儿和刚出生幼儿的胰岛细胞和一些导管细胞 th呈阳性。成年大鼠胰腺中

13、，th仅在b细胞中表达。th的 这种表达模式可用于鉴别内分泌前体细胞14。葡萄糖转 运子2 (glucosetransporter, glut-2):可在大鼠胚胎的背 胰芽和腹胰芽细胞中检出，并在胰芽发育中持续表达。孕 17d,可检测到细胞内表达glut-2和胰岛素，以后，这些细 胞聚集形成胰岛的b细胞群，而那些将转变成腺泡细胞的 细胞不再表达glut-2 15。细胞角蛋白20 (cytokeratin, ck20) :ck20是成熟胰腺导管细胞的一个特异标志。在胎鼠 和幼鼠的导管细胞和内分泌细胞中表达，而在成年动物的导 管细胞中有ck20表达则提示能定向分化成内外分泌细胞的胰腺未分化细胞。诱

14、导与导管连接的b细胞再生时，ck20 也可在内分泌细胞中表达，显示了未分化细胞分化为内分泌 细胞的过程15。pdx-1：是b细胞成熟的标志。在哺乳动 物中，这种同源域蛋白(homeodomainprotein)是一种调节 胰岛素和抑生长素表达的转录因子，也作为胰岛素启动因子 -1 (ipf-1)、抑生长素活化因子-1 (stf-1)和胰岛十二指 肠同源域蛋白(idx-1)而存在。pdx-1也可在尚未形成胎儿 胰腺上皮细胞的所有胰岛素分泌细胞中短暂表达(bouwens, micros. res. tech, 1998)o kit：kit在胰岛素细胞系中表达, 认为在信号转导方面起作用。胎鼠和成鼠

15、的胰岛中均可检测 到kit,经kit基因表达的标记物gal证实，kit在胰岛素 细胞中特异表达，在其他内分泌细胞和外分泌细胞中不表达 16。ngn3：ngn3阳性细胞散在于胎鼠胰腺的导管细胞，胚 胎15. 5d达高峰，成熟胰岛细胞则转为阴性17。由于胰 岛激素或成熟内分泌细胞不表达ngn3,因此ngn3阳性细胞 可作为胰腺内分泌细胞的前体细胞的标记物18。波形蛋 白(vimentin) ：schmied 19将长期培养的胰岛细胞去分 化得到未分化的导管样上皮细胞，这些细胞可分化成胰腺内 外分泌细胞，并限制性表达波形蛋白，所以波形蛋白可作为 胰岛祖细胞的分子标志。但在此需说明的是，最近研究人员用

16、小鼠做了详细的追踪研究，matthews 20通过孕鼠 及乳鼠喂养不同剂量的维生素a,发现缺乏维生素a, b细 胞数量和体积明显下降。cheny 21等发现s0cs-1 (-/-) 鼠感染后外分泌部细胞死亡高于内分泌部，可能v干扰素 或肿瘤坏死因子促进内分泌部增生分化。gesina 22通过 糖皮质激素治疗通过转基因技术使激素受体缺陷的鼠，发现 胰岛素分泌细胞减少是外分泌细胞的2倍，提示糖皮质激素 有利于向外分泌分化。表达pax-1, pax-6, nkx6. 1处下游 调控序列，而paf-l-p48和hes-1的mrna增高。选择非活 化激素受体基因，在鼠b细胞无明显效果。而对于缺乏糖 皮质

17、激素受体，且表达pdx-1则b细胞群增长加倍。胰岛 细胞数量和体积均增大而a细胞除外。提示糖皮质激素在 胰腺b细胞分化中具有重要作用。 2诱导干细胞分化为 胰岛的研究近况 应用生物工程技术获取胰岛素分泌细 胞可从以下几个途径：(1)胰导管干细胞；(2)胚胎干细胞;(3)利用基因工程技术。但将这些细胞诱导成胰岛，仅是 实验室研究的初级阶段，并不是最终的成果。2.1胰导管干细胞应用(1) peck 23和ramiya 24分离、提取 出了存在于胰腺导管中的胰岛干细胞，经体外诱导培养形成 了胰岛样细胞。(2) bonner 25发现角质化细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor

18、, kgf)和烟碱(nicotine)对导管干细胞分化为胰岛产生作用。(3) ramiya 26从胰腺导管上皮细胞诱导分化得到“产生胰岛的干细胞(isletproducingstemcells, ipscs)",这些 ipscs 呈较 典型的胰岛样结构，并对高浓度葡萄糖有胰岛素释放应答反 应，免疫组织化学染色证实有胰岛素和胰高糖素的表达， rt-pcr显示这些细胞能表达许多胰岛细胞的标志性基因，如 胰岛素基因，胰高糖素，生长抑素，glut2及谷氨酸脱竣酶 等。将分化成熟的胰岛细胞移植到nod鼠体内，可完全逆转 其dm状态25。由ipscs可诱导分化得到“产生胰岛的细 胞"（

19、isletproducingcells, ipcs）, ipcs 可分化成有组织 结构的胰岛细胞团，包括a、b、d细胞，表达一系列胰岛标 志，分泌胰岛素并受葡萄糖诱导。将这些细胞移植到nod鼠 体内，可稳定其血糖水平。2. 2胚胎干细胞应用（1） lumelsky 27采用胚胎干细 胞体外扩增后，筛选巢蛋白（nestin）阳性细胞，加入碱性成纤维细胞生 长因子 （basicfibroblastgrowthfactor, bfgf）及b27和尼可酰胺，诱导成为能分泌胰岛素的胰岛样结构，将其植入糖尿病鼠体内，可使血糖降低且有血管形成, 只是胰岛素分泌量较低o (2) assady 28从es细胞诱

20、导分化得到可分泌胰岛 素的细胞，他们的方法是先将es细胞在有白血病抑制因子 (leukaemiainbibitoryfactor, lif)存在，但无滋养层的条件下培养，此时有pdx1 (pancreaticandduodenalhomeoboxl)表达，然后在无lif的条件下促进es细胞增殖分化为拟 胚体(embryobodys, ebs),再在无血清环境下培养，提高nestin+细胞的比例，加 入bfgf继续培养，得到类胰岛组织细胞。这些细胞表达145pgug的鼠胰岛素i和 ii,而且其表达受葡萄糖诱导，还表达胰岛淀粉多肽(isletamyloidpolypep _ tide), glut

21、2等胰岛细胞标志。但将这些细胞移植入糖尿病小鼠后，未能使其血糖正常化。(3) sori " a 29通过转基因技术将基因插件插入到小鼠胚胎干细胞 中，经潮霉素(hygromycin)筛选，获得含上述基因插件的干细胞，扩增后用g418 筛选，从而获得纯化的胰岛。参考文献ldochertyk growthanddevelopmentoftheisletsoflangerhans：implica - tionsforthetreatmentofdiabetesmellitus curre ntopinioninpharmacolo - gy, 2001, 1:641-650.2ferber

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