参与DNA复制有关的酶和蛋白质PPT课件

1、 现在已经知道约现在已经知道约2020多种蛋白质参与复制。多种蛋白质参与复制。（1 1）聚合酶）聚合酶（2 2）解解 链、链、 解解 旋旋 酶酶 类类（3 3）引发酶）引发酶（4 4）连接酶）连接酶 下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。下表是与大肠杆菌复制有关的蛋白质。第1页/共51页蛋白质名称蛋白质名称分子量分子量103U亚基数亚基数 功功 能能每个菌中的每个菌中的分子数分子数毫克蛋白质毫克蛋白质公斤细胞（湿重）公斤细胞（湿重）SSBi蛋白蛋白n蛋白蛋白n 蛋白蛋白n蛋白蛋白dnaCdnaB引发酶引发酶 74 80 25 75 11 29300 6044111161与单链结合与单链结合预引发预

2、引发预引发预引发部位识别部位识别,ATPase预引发预引发预引发预引发移动启动子移动启动子,ATPase引发合成引发合成300 50 30 70 -100 20 50 20 0.5 0.3 0.3 0.2表表 与大肠杆菌复制有关的蛋白质与大肠杆菌复制有关的蛋白质接下页接下页BACK第2页/共51页蛋白质名称蛋白质名称分子量分子量103U亚基数亚基数 功功 能能每个菌中的分子每个菌中的分子数数毫克蛋白质毫克蛋白质公斤细胞（湿重）公斤细胞（湿重）Pol 全酶全酶 140 25 10 37 52 32 831121211链的延长链的延长30020 0.5Pol 1091填补缺口和切去引填补缺口和切去

3、引物物30010连接酶连接酶 741连接连接30010拓扑异构酶拓扑异构酶 400 210 190422引进超螺旋引进超螺旋_25025rep 蛋白蛋白 解链酶解链酶dnaA 65 75 4811解开双链解开双链复制起始复制起始5050002000.6Rep蛋白是一种大肠杆菌解链酶蛋白是一种大肠杆菌解链酶第3页/共51页 1 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。的一类酶。 全称：全称： DNA依赖的依赖的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-p

4、ol活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性第4页/共51页 所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它们催化脱氧核苷三磷酸加到复制中的DNA链的3羟基末端，合成方向从53，由模板决定加上何种脱氧核苷酸。 第5页/共51页5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其

5、水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目 录第6页/共51页第7页/共51页DNADNA聚合酶的分类聚合酶的分类DNA-pol 主要的修复酶主要的修复酶DNA-pol 次要的修复酶次要的修复酶DNA-pol 复制酶复制酶DNA-pol IV SOS修复修复DNA-pol V SOS修复修复原核生物的聚合酶原核生物的聚合酶第8页/共51页 (1) 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I (Pol ) 纯的纯的DNA聚合酶聚合酶I由分子量由分子量109 000U (109KD)，含，含928个氨基酸残基的个氨基酸残基的一条肽链构成，每个大肠杆菌细胞中大约含一条肽链构成，每个大肠杆菌细胞中大约含400

6、个酶分子。个酶分子。(单链多肽）单链多肽） 功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。第9页/共51页323个氨基酸个氨基酸小片段（小片段（34KD）5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 （76KD）604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶胰蛋白酶DNA-pol 第10页/共51页DNA聚合酶聚合酶的的多种活性。多种活性。 53聚合活性：聚合活性： 在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底

7、物在引物在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物在引物3-OH末端加上脱氧核末端加上脱氧核苷酸苷酸。每个酶分子每分钟添加。每个酶分子每分钟添加1 000个单核苷酸。个单核苷酸。 聚合酶催化的聚合酶催化的DNA的合成需要以下条件：的合成需要以下条件： 模板模板 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 必须有一必须有一 3-OH末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键末端的引物，且此引物必须与模板正确形成氢键 合成从合成从53方向进行，如图方向进行，如图7-8和图和图7-9所示所示第11页/共51页第12页/共51页 35外切酶活性：外切酶活性：没有脱氧核苷三磷酸底物时没有脱氧核苷三磷酸底物时，DNA聚合酶聚

8、合酶 I 能从能从3-OH开开始以始以35方向水解方向水解DNA，产生，产生5-单核苷酸。单核苷酸。 实际上实际上DNA复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正复制时，加上去的脱氧核苷酸不一定每次都正确，错误的机会不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷确，错误的机会不少，有时甚至加上一个不与模板配对的核苷酸，酸，当当3-OH末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，末端的碱基不与模板配对时聚合酶就无聚合活性，此时它具有的此时它具有的35外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，外切酶活性可以切除这个不配对的核苷酸，这一碱基切除后，外切核酸酶活性终止，聚合酶活性恢复，这一碱基切除后，外切核酸酶活

9、性终止，聚合酶活性恢复，如如图图7-10所示。所以聚合酶的所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫外切酶活性也叫修补活性修补活性。第13页/共51页第14页/共51页 53外切酶活性：外切酶活性： DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性。外切酶活性。 如图如图7-11，其特点是：，其特点是： 只能在只能在5-P末端一个接一个地切除核苷酸；末端一个接一个地切除核苷酸； 能连续地切除多个核苷酸；能连续地切除多个核苷酸； 只切除配对的只切除配对的5-P末端核苷酸，不切除不配对的单链末端核苷酸，不切除不配对的单链5-P末端核苷酸；末端核苷酸； 既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；既能切除脱氧核苷酸也能切

10、除核苷酸； 对只具有对只具有5-P末端的切口也有活性（由于在末端的切口也有活性（由于在DNA复制过复制过程中一般情况下只在程中一般情况下只在RNA引物处才有缺口，引物处才有缺口，因此因此53外切酶外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物）。）。 第15页/共51页第16页/共51页 切口翻译切口翻译(nicktranslation) DNA聚合酶聚合酶 I 的的53外切酶活性和聚合活性同时作用可外切酶活性和聚合活性同时作用可以进行切口翻译以进行切口翻译(nicktranslation)，用来，用来制造放射性探针制造放射性探针。 在反应物里加入同位素标记的脱氧单

11、核苷酸，在反应物里加入同位素标记的脱氧单核苷酸，DNA聚合酶聚合酶I 首先利用首先利用53外切酶活性，从切口处逐个切下外切酶活性，从切口处逐个切下DNA上的核苷上的核苷酸，再利用酸，再利用3-OH末端聚合作用末端聚合作用逐个将标记的核苷酸加上去逐个将标记的核苷酸加上去(图图712)。第17页/共51页5353第18页/共51页 内切酶活性：内切酶活性：DNA聚合酶聚合酶 I 也具有也具有53 内切酶活性，如图内切酶活性，如图7-13所示。在两个碱基之所示。在两个碱基之间切开产生一个具有间切开产生一个具有5-P 末端的末端的不配对碱基的片段不配对碱基的片段。 很多实验证明很多实验证明DNA聚合酶

12、聚合酶 I 在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而在大肠杆菌复制中不是主要的合成酶，而是是在除去在除去RNA引物和损伤修复中起重要作用。引物和损伤修复中起重要作用。第19页/共51页不配对的片段不配对的片段内切酶活性内切酶活性第20页/共51页 （2） 大肠杆菌大肠杆菌 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这表明缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApol不是不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于聚合酶，并于1970年发现了年发现了DNApol。 从从53方向合成方向合成DNA 具有具有35外切酶活性外切酶活性，但

13、没有，但没有53外切酶活性。外切酶活性。 在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷在体外的合成速率比体内的速率要低得多，带有这个酶缺陷的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能的大肠杆菌突变株染色体的复制各方面都正常，它在体内的功能可能和可能和DNA聚合酶聚合酶 I 类似。类似。 第21页/共51页 (3) 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 聚合酶聚合酶是体内是体内DNA复制所必需的酶复制所必需的酶 带有带有DNA聚合酶聚合酶 的温度敏感突变的温度敏感突变 (polc) 的大肠杆菌在限制温度的大肠杆菌在限制温度下是不能存活的，从这种菌株得到的裂解液也不能合成下是不能

14、存活的，从这种菌株得到的裂解液也不能合成DNA，当加入正，当加入正常细菌的常细菌的DNA 聚合酶聚合酶 时可以恢复它的聚合能力，因此不同于时可以恢复它的聚合能力，因此不同于DNA聚聚合酶合酶I和和，聚合酶聚合酶是体内是体内DNA复制所必需的酶。复制所必需的酶。 DNA多聚酶多聚酶相当复杂，其结构和各亚基的功能如图相当复杂，其结构和各亚基的功能如图1124，25所示。所示。 DNA pol 具有具有53聚合功能。聚合功能。 第22页/共51页DNA聚合酶聚合酶 的的 “核心酶核心酶”由由、三种亚基组成。三种亚基组成。 亚基具有合成亚基具有合成DNA的能力。的能力。 亚基具有亚基具有35外切酶的功

15、能，起到外切酶的功能，起到校正的作用。校正的作用。 亚基可能在组装中发挥功能。亚基可能在组装中发挥功能。亚基加到核心酶上使其二聚化，亚基加到核心酶上使其二聚化，进一步产生进一步产生pol III。复合体加入到复合体加入到pol ，进一，进一步形成步形成 pol 复合体。复合体。 复合体是由复合体是由，和和亚基组成，其作用是固定亚基组成，其作用是固定亚基这个亚基这个“夹子夹子”的支架。的支架。亚基亚基：形成夹钳，保持催化核形成夹钳，保持催化核心和模板链的结合心和模板链的结合第23页/共51页 聚合酶聚合酶的活性的活性 聚合活性：聚合活性： DNA复制时聚合酶复制时聚合酶 全酶十分重要，它可以全酶

16、十分重要，它可以在在DNA模板上的引物的模板上的引物的3-OH上以每分钟约上以每分钟约50 000核苷酸的速核苷酸的速率逐个延伸新生的率逐个延伸新生的DNA。 35和和53的外切酶活性：的外切酶活性： pol 的的53外切酶活性与外切酶活性与pol的不同，的不同，pol 的的53外切酶活性只对外切酶活性只对 单链单链 DNA有作用，因此不能用于缺口翻译。有作用，因此不能用于缺口翻译。DNA聚合酶聚合酶的作用范围如图的作用范围如图7-14所示。所示。 第24页/共51页第25页/共51页催化DNA聚合参与DNA损伤的应急状态修复修复合成、切除引物、填补空隙功能2040400分子数/细胞1011亚

17、基数+-+5 外切酶活性+ 5 外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶第26页/共51页 (4) 真核生物中的真核生物中的DNA聚合酶聚合酶 所有真核生物中的聚合酶的性质基本上同大肠杆菌中的所有真核生物中的聚合酶的性质基本上同大肠杆菌中的聚合酶相似，它的活性有赖于模板，带聚合酶相似，它的活性有赖于模板，带3-OH的引物，四种脱的引物，四种脱氧核糖核苷磷酸。氧核糖核苷磷酸。 目前发现的真核生物目前发现的真核生物DNA聚合酶有聚合酶有 。 DNA聚合酶聚合酶： 在迅速增殖的细胞中活力较高。酶分子在迅速增殖的细胞中活力较高。酶分子量在量

18、在165,000一一175,000U之间。最合适的底物是带缺口的双链之间。最合适的底物是带缺口的双链DNA，但是带引物的变性，但是带引物的变性DNA也是很好的底物。是真核生物也是很好的底物。是真核生物的复制酶。的复制酶。 它同大肠杆菌它同大肠杆菌DNA聚合酶最大不同之处在于聚合酶最大不同之处在于不具外切酶不具外切酶活性活性。 第27页/共51页 DNA聚合酶聚合酶(损伤修复损伤修复)：为分子量较小为分子量较小(43,000U)的聚合酶。在整个细的聚合酶。在整个细胞周期中它的活力没有变化，它利用胞周期中它的活力没有变化，它利用Dnase I 处理过的天然处理过的天然DNA作模板，作模板，对对变性

19、变性DNA几乎没有活性，不具外切酶的活性几乎没有活性，不具外切酶的活性。 DNA聚合酶聚合酶（线粒体）：（线粒体）：是一个大分子酶，在细胞内含量很低，因是一个大分子酶，在细胞内含量很低，因此不容易纯化。这个酶可以使用带缺口的此不容易纯化。这个酶可以使用带缺口的DNA作底物，但以多聚作底物，但以多聚(A)、寡聚、寡聚(dT)8-10作为底物，酶活力更高。作为底物，酶活力更高。 DNA聚合酶聚合酶负责线粒体负责线粒体DNA的复制。的复制。 DNA聚合酶聚合酶和和DNA聚合酶聚合酶（主要复制酶）（主要复制酶）: 是真核生物的复制酶，是真核生物的复制酶，主要根据是聚合酶主要根据是聚合酶的活性随细胞周期

20、而变化。的活性随细胞周期而变化。 DNA聚合酶聚合酶：功能不详。：功能不详。第28页/共51页 2 DNA连接酶连接酶 DNA Ligase DNA连接酶催化一个连接酶催化一个DNA链的链的5磷酸根与另一磷酸根与另一DNA链的链的3羟基形成磷酸二酯键。羟基形成磷酸二酯键。 但两个链都必须与同一另外的链互补结合，而且两链必须但两个链都必须与同一另外的链互补结合，而且两链必须相邻，即只能连接一个切口相邻，即只能连接一个切口(nick)而不能连接一个豁口而不能连接一个豁口(gap)(丢丢失核苷酸失核苷酸)，如，如图图7-15所示。所示。例子：例子：T4诱导的连接酶不仅能诱导的连接酶不仅能在模板上连接

21、在模板上连接DNA和和DNA之间的之间的切口，也能连接切口，也能连接RNA和和RNA之间的切口，不仅能连接之间的切口，不仅能连接DNA中中的单链切口或双链的粘性末端，而且能连接平头双链的单链切口或双链的粘性末端，而且能连接平头双链DNA 。大大肠杆菌连接酶则不行肠杆菌连接酶则不行。 第29页/共51页第30页/共51页3 与解链有关的酶和蛋白质与解链有关的酶和蛋白质 DNA是双螺旋，在复制中双螺旋要解开，双螺旋的解是双螺旋，在复制中双螺旋要解开，双螺旋的解开使得复制叉前面产生正超螺旋，如果这些应力不以某种开使得复制叉前面产生正超螺旋，如果这些应力不以某种方式释放将妨碍复制叉前进。方式释放将妨碍

22、复制叉前进。 现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使DNA双链双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介绍一变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介绍一些这类蛋白质。些这类蛋白质。 第31页/共51页 (1) 单链结合蛋白单链结合蛋白 (SSB蛋白蛋白) SSB蛋白：蛋白：是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，可以在远低是缺乏酶活性的复制辅助蛋白，可以在远低于于Tm的温度下使双链的温度下使双链DNA拆开，并牢牢地结合在单链拆开，并牢牢地结合在单链DNA上，稳定单链区域的蛋白质。上，稳定单链区域的蛋白质。（ SSB保护复制中的保护复制中的DNA单链部分单

23、链部分不被核酸酶降解）不被核酸酶降解） 首先在大肠杆菌中发现，后来发现许多种生物中都有这首先在大肠杆菌中发现，后来发现许多种生物中都有这类蛋白质。在文献中，这类蛋白曾用过多种名称：解旋蛋白类蛋白质。在文献中，这类蛋白曾用过多种名称：解旋蛋白(unwindingproteill)，熔化蛋白，熔化蛋白(mel2ingprptein)，螺旋降稳蛋，螺旋降稳蛋白白(helixdestabizingprotein)。 第32页/共51页 (2) 解链酶（解链酶（DNA解旋酶；解旋酶；DNA helicases） 解链酶解链酶(解螺旋酶解螺旋酶)：是一类能通过水解是一类能通过水解ATP获得能量来解开获得能

24、量来解开双链双链DNA的酶称为的酶称为DNA解链酶解链酶。解链酶依赖于单链解链酶依赖于单链DNA 的存在的存在 分解分解ATP获得能量获得能量 具具引发酶的功能引发酶的功能（合（合成小片段的成小片段的RNA作为后随链的引物作为后随链的引物） 如果双链如果双链DNA中有中有单链末端或缺口单链末端或缺口，则，则DNA解链酶可以首先结解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动，复制时大部分合在这一部分，然后逐步向双链方向移动，复制时大部分DNA解解链酶可以沿着后随链模板的链酶可以沿着后随链模板的53方向随着复制叉的前进而移动，方向随着复制叉的前进而移动，只有只有rep蛋白（蛋白（一种大肠杆

25、菌解链酶）一种大肠杆菌解链酶）是沿前导链模板的是沿前导链模板的35方方向移动。因此在复制时向移动。因此在复制时rep蛋白和某蛋白和某DNA解链酶分别在解链酶分别在DNA的两的两条母链上协同作用以解开双链条母链上协同作用以解开双链DNA（图图7-16） 第33页/共51页第34页/共51页第35页/共51页 (3) 拓扑异构酶(Topoisomerase)： 是催化DNA拓扑异构体(Topoisomer)相互转换的一类酶。 拓扑异构酶能与DNA形成共价结合的蛋白质-DNA中间体，从而在其骨架的磷酸二酯键处造成暂时性裂口，使DNA的多核苷酸链得以穿越，从而改变DNA分子的拓扑状态。 根据酶作用的机

26、理及其介导一条链还是二条链的断裂，拓扑异构酶可分为型和型。第36页/共51页 型拓扑异构酶的共同特点是： 仅切断双链DNA中的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接。 不需要能量辅助因子，如ATP和NAD等，因此不能催化需能的超螺旋化结构。型拓扑异构酶一般都使高度超螺旋的DNA松弛。 型拓扑异构酶的共同特点是： 同时切断、缝合DNA的两条链。 需要能量辅助因子，可以作用于任何相交的两对双链DNA。第37页/共51页 大肠杆菌拓扑异构酶大肠杆菌拓扑异构酶I（属于（属于型酶型酶） 概述：拓扑异构酶概述：拓扑异构酶 (E. coli)催化负超螺旋催化负超螺旋DNA的的松弛松弛。 拓扑异构酶拓扑异构酶也参

27、与也参与DNA的打结和解结。的打结和解结。 将两个互补的单链将两个互补的单链DNA环耦合为双链环耦合为双链DNA环。环。 完整的全酶是一分子量完整的全酶是一分子量97 kDa的蛋白。的蛋白。第38页/共51页 大肠杆菌拓扑异构酶 I 的特点是： 仅切断双链DNA中的单链并催化瞬时的单链断裂和连接。 由于反应的产物还是闭环DNA，因此，酶反应机制是先切开双链DNA中的一条链，使切开链的末端沿螺旋的方向转动，然后把切口封起来，达到松旋的目的。 不需要能量辅助因子。如：ATP NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) ，最初从大肠杆菌中分离到一种叫蛋白，后来定名为大肠杆菌拓扑异构酶 I 。第39页/共51页

28、StructureoftheTopoI/contactwithDNA第40页/共51页 后来发现这种酶广泛存在于各种生物中，不同学者曾给后来发现这种酶广泛存在于各种生物中，不同学者曾给予各种命名：予各种命名：转轴酶转轴酶(swivelase)，松旋酶松旋酶(untwisting enzyme)，DNA松弛酶松弛酶(DNA relaxing enzyme)，切割封口酶切割封口酶(nickingclosing enzyme)。 Topo I 酶松弛超螺旋酶松弛超螺旋DNA时不需要时不需要ATP，它可以催化三，它可以催化三种拓扑转换反应种拓扑转换反应(图图7-17)。第41页/共51页拓扑异构酶拓扑异构酶 I (E. coli)催化负超螺旋催化负超螺旋DNA的的松弛。松弛。拓扑异构酶拓扑异构酶 I也参与也参与DNA的打结和解结。的打结和解结。 将两个互补的单链将两个互补的单链DNA环耦合为双链环耦合为双链DNA环。环。第42页/共51页TopoIReactions仅切断双链DNA的一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接，不需要能量辅助因子如ATP和NAD等第43页/共51页TopoI作用机制23图图2-21 拓扑异构酶拓扑异构酶的作用机制的作用机制第44